ГОСТ Р ИСО 20166-2-2021 Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных формалином тканей в парафиновых блоках (FFPE). Часть 2. Выделенные белки

    ГОСТ Р ИСО 20166-2-2021

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Молекулярные диагностические исследования in vitro

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЦЕССАМ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАФИКСИРОВАННЫХ ФОРМАЛИНОМ ТКАНЕЙ В ПАРАФИНОВЫХ БЛОКАХ (FFPE)

Часть 2

Выделенные белки

Molecular in vitro diagnostic examinations. Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue. Part 2. Isolated proteins

ОКС 11.100.10

Дата введения 2022-04-01

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины" (Ассоциация "ФЛМ") (Комитетом по молекулярной диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний "ФЛМ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 октября 2021 г. N 1217-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20166-2:2018* "Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов тканей (FFPE). Часть 2. Изолированные белки" (ISO 20166-2:2018 "Molecular in vitro diagnostic examinations - Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue - Part 2: Isolated proteins", IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ISO/ТС 212 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro".

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.

Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

Введение

Молекулярная диагностика in vitro, включая молекулярную патологию, позволила добиться значительного прогресса в медицине. Ожидается дальнейший прогресс в области новых технологий анализа нуклеиновых кислот, белков и метаболитов в тканях и жидкостях человеческого организма. Однако в процессе сбора, транспортирования, хранения и обработки образцов профиль и (или) целостность молекул может претерпеть радикальные изменения, что приведет к ненадежности или даже невозможности диагностики в связи с тем, что результаты исследования будут соответствовать не реальному состоянию пациента, а отражать искаженный профиль, возникший в результате процессов, произошедших с образцом до проведения исследования.

Первоначально считалось, что это невозможно из-за сшивающих активностей формальдегида, в последние годы были значительно усовершенствованы методики выделения белков из тканей в парафиновых блоках (FFPE), несмотря на изначальные затруднения из-за сшивающих активностей формалина. Термоиндуцированное реверсирование индуцированных формальдегидом поперечных связей было важным шагом в процедурах выделения белка. В настоящее время большинство исследователей признают, что белки, выделенные из тканей в парафиновых блоках (FFPE), пригодны для последующего протеомного исследования.

Белковые профили, целостность белков и взаимодействие белка с белком в тканях могут резко изменяться до, во время и после сбора (например, из-за индукции генов, регуляции снижения генов, деградации белков). Количество видов белка может изменяться по-разному в тканях от разных пациентов/доноров. На экспрессию генов может влиять проводимое лечение или вмешательство (хирургическое вмешательство, биопсия), или препараты, вводимые для обезболивания или даже лечение сопутствующего заболевания, а также различные условия окружающей среды после удаления ткани из организма.

Кроме того, процессы фиксации ткани формалином и заливки парафином приводят к модификации белковых молекул, что может повлиять на правильность и надежность результатов исследования.

Поэтому для последующих исследований крайне важно принять специальные меры для минимизации описанных изменений белкового профиля и изменений ткани.

Необходима стандартизация всего процесса от сбора образцов до исследования белка. Были проведены исследования для определения главных факторов, влияющих на эти процессы. Настоящий стандарт основан на исследовательских работах по кодификации и стандартизации процедур для тканей в парафиновых блоках (FFPE) в отношении исследования белка на преаналитическом этапе.

В настоящем стандарте использованы следующие формулировки:

- "должен/должна/должно" указывает на требование;

- "следует" указывает на рекомендацию;

- "мог/могла/могло бы" указывает на разрешение;

- "может/способен" указывает на способность или возможность.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к транспортированию, документированию, хранению и обработке образцов тканей в парафиновых блоках (FFPE), предназначенных для исследования выделенных белков на преаналитическом этапе перед проведением молекулярного анализа.

Настоящий стандарт применим к молекулярным диагностическим исследованиям in vitro, включая лабораторно разработанные тесты, выполняемые медицинскими лабораториями и лабораториями молекулярной патологии*. Также он предназначен для использования поставщиками, разработчиками и изготовителями диагностики in vitro, биобанками, учреждениями и коммерческими организациями, осуществляющими биомедицинские исследования, а также регулирующими органами**.

________________

* В Российской Федерации к термину "лабораторно разработанные тесты" (медицинские изделия или методики их применения, разработанные в лаборатории для собственного применения) применяется определение "незарегистрированные медицинские изделия для диагностики in vitro".

** Государственный контроль за обращением медицинских изделий осуществляется уполномоченным Правительством Российской Федерации федеральным органом исполнительной власти. В настоящее время - Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения.

Настоящий стандарт не применим для исследований белка методом иммуногистохимии.

Примечание - Международные, национальные, региональные правила или требования могут также применяться к отдельным частям настоящего стандарта.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 15189:2012, Medical laboratories - Requirements for quality and competence (Медицинские лаборатории. Специальные Требования к качеству и компетентности)

ISO 15190, Medical laboratories - Requirements for safety (Лаборатории медицинские. Требования безопасности)

ISO/IEC 17020:2012, Conformity assessment - Requirements for the operation of various types of bodies performing inspection (Оценка соответствия. Требования к работе различных типов органов инспекции)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ИСО 15189, а также следующие термины с соответствующими определениями.

Терминологические базы данных ИСО и МЭК доступны по следующим адресам:

- платформа онлайн-просмотра ИСО: //www.iso.org/obp;

- электропедия МЭК: //www.electropedia.org/.

3.1 аликвота (aliquot): Часть от большего количества гомогенного материала, при взятии которого допустима незначительная погрешность выборки.

Примечание 1 - Этот термин обычно применяется к жидкостям. Ткани гетерогенны и, как следствие, аликвота тканей не может быть взята.

Примечание 2 - Определение составлено на основе информации из источников [28], [29] и [30].

3.2 температура окружающей среды (ambient temperature): Нерегулируемая температура окружающего воздуха.

3.3 аналит (analyte): Компонент, представленный в наименовании измеряемой величины.

[ИСО 17511:2003, 3.2, изменен - примечание удалено]

3.4 аналитические характеристики теста (методики) (analytical test performance): Точность, погрешность и чувствительность теста для измерения искомого аналита (3.3).

Примечание 1 - Также могут применяться другие характеристики продуктивности метода исследования, такие как надежность, повторяемость.

3.5 экстракорпоральное хранение (холодовая ишемия) (cold ischemia): Условия хранения образца от момента извлечения из организма до стабилизации и фиксации.

3.6 диагноз (diagnosis): Заключение о состоянии здоровья или наличия заболевания по его признакам и (или) симптомам; процесс постановки диагноза может включать обследования и исследования (см. 3.7) для отнесения состояния индивидуума к принятым классификациям и номенклатуре болезней, что позволяет принимать медицинские решения по прогнозу и лечению.

3.7 исследование, аналитический тест (анализ) (examination, analytical test): Ряд операций, имеющий объектом определения значения или характеристики свойства.

Примечание - Процессы, которые начинаются с изолированного аналита и включают в себя все виды тестирования параметров или химические манипуляции для количественного или качественного исследования.

3.8 формалин (formalin): Насыщенный водный раствор формальдегида, который на 100% содержит 37% формальдегида по массе (что соответствует 40% по объему).

3.9 фиксация формалином (formalin fixation): Обработка образца (исходного образца, первичной пробы) стандартным забуференным раствором формалина (см. 3.21) для стабилизации.

3.10 макроскопическое исследование (grossing): Осмотр образцов невооруженным глазом для получения диагностической информации и обработка для дальнейшего микроскопического исследования.

3.11 заливка парафином (paraffin embedding): Процесс заливки образца ткани в парафиновый блок (см. 3.19) для создания твердой внешней матрицы для получения тонких срезов, пригодных для микроскопирования.

3.12 процесс подготовки, преаналитический этап, преаналитический рабочий процесс (preexamination process, preanalytical phase, preanalytical workflow): Процесс, который в хронологическом порядке начинается с клинического запроса, включающий оценку направления, подготовку и идентификацию пациента, сбор образцов, транспортирование в клинико-диагностическую лабораторию или в лабораторию патолого-анатомического отделения, выделение аналита и завершается началом аналитического исследования.

Примечание 1 - Преаналитический этап включает подготовительные процессы, влияющие на планируемое исследование.

[ИСО 15189:2012, 3.15, изменен - "преаналитический этап" был добавлен в качестве термина, добавлено примечание 1 и расширено определение]

3.13 первичный образец, проба (primary sample, specimen): Дискретная порция биологической жидкости, выдыхаемого воздуха, волос или тканей, взятая для исследования (3.7), изучения или анализа одной или нескольких величин или свойств, которые предполагается приписать целому.

[ИСО 15189:2012, 3.16, изменен - примечания 1-3 удалены]*

________________

* В Российской Федерации для характеристики биологических жидкостей используют термин "первичная проба (проба)", для характеристики биологических тканей - термин "образец (часть образца)".

3.14 белок (protein): Тип биологической макромолекулы, состоящей из одной или нескольких цепей определенной последовательностью аминокислот, соединенных пептидными связями.

3.15 профиль белка (protein profile): Количество отдельных молекул белка (см. 3.14), которые присутствуют в образце и которые могут быть измерены при отсутствии каких-либо потерь, ингибирования и вмешательства.

3.16 виды белков (protein species): Совокупность химически точно определенных белков, соответствующих одному пятну на изображении двумерного гель-электрофореза высокого разрешения.

Примечание 1 - Определение взято из ссылки [7].

3.17 посттрансляционная модификация (post-translational modification): Химические изменения первичной структуры белка, часто имеющие важнейшее значение для биологической активности этого белка.

Примечание 1 - Определение взято из ссылки [8].

3.18 комнатная температура (room temperature): Для целей настоящего стандарта температура в пределах от 18°С до 25°С.

Примечание 1 - Национальные правила или требования могут иметь различные определения.

3.19 проба (sample)**: Одна или несколько частей, которые взяты из первичной пробы (3.13).

________________

** В настоящем стандарте используется понятие "фрагмент" как часть образца вместо "пробы" как часть первичной пробы.

[ИСО 15189:2012, 3.24, изменен - пример удален]

3.20 стабильность (stability): Характеристика материала пробы, описывающая ее способность сохранять значения свойства в определенных пределах в течение определенного периода времени при хранении в определенных условиях.

Примечание 1 - Для процессов, описанных в настоящем стандарте, аналитом является выделенный белок.

[Руководство ИСО 30:2015, 2.1.15, изменен - "стандартный образец" заменен на "материал пробы", "способность" заменена на "характеристика, описывающая возможность", также изменено примечание 1]

3.21 стандартный забуференный раствор формалина, нейтральный буферный формалин; НБФ (standard buffered formalin solution, neutral buffered formalin, NBF): 10%-ный раствор формалина (3.8) в воде с массовой долей 3,7% (соответствующей объемной доле 4%) формальдегида, буферизированный до рН 6,8-7,2.

Примечание 1 - Стандартные буферные растворы формалина часто содержат небольшое количество метанола для замедления окисления и полимеризации формальдегида.

3.22 хранение (storage): Длительный период прерывания преаналитического этапа исследования образца (3.12) или аналита, или его производных, таких как окрашенные препараты на стекле или образцы ткани в парафиновых блоках, в соответствующих условиях при условии сохранения свойств образца.

Примечание 1 - Долгосрочное хранение обычно осуществляется в лабораторных хранилищах или в биобанках.

3.23 гистологический процессор (tissue processor): Аппарат для автоматизированной проводки тканей, в которой происходит их фиксация, дегидратация и пропитывание парафином.

3.24 валидация (validation): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены.

Примечание 1 - Термин "валидирован" используется для обозначения соответствующего статуса.

[ИСО 9000:2015, 3.8.13, изменен - примечания 1 и 3 удалены]

3.25 интракорпоральная ишемия (warm ischemia): Состояние ткани или органа во время хирургических или диагностических манипуляций, уже лишенных нормального кровоснабжения до момента извлечения из организма.

3.26 рабочий процесс (workflow): Последовательные действия, необходимые для выполнения задачи.

3.27 гомогенный (homogeneous): Однородный по структуре и составу.

4 Общие сведения

Общие сведения о системах менеджмента качества медицинских лабораторий и, в частности, о сборе, приеме и обработки образцов (включая предотвращение перекрестного заражения) приведены в ИСО 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 или ИСО/МЭК 17020:2012, раздел 8 и 7.2. Должны соблюдаться требования к лабораторному оборудованию, реагентам и исходным материалам в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.3; ИСО 15189:2012, 5.5.1.2 и 5.5.1.3, а также ИСО/МЭК 17020:2012, 6.2.

Все этапы диагностического рабочего процесса могут влиять на конечный результат аналитического теста. Таким образом, весь рабочий процесс, включая стабильность биомолекул и условия хранения образца, должен быть проверен и валидирован. Этапы рабочего процесса, которые не всегда поддаются контролю (например, интракорпоральная ишемия), должны быть задокументированы. Должна быть проведена оценка риска неконтролируемых этапов, включая их потенциальное влияние на результаты аналитических испытаний, и приняты меры по предотвращению последствий для обеспечения требуемых результатов аналитических тестов.

Стабильность конкретного белка(ов), представляющего интерес, и его (их) посттрансляционные модификации (если они важны для анализа) должны быть изучены на протяжении всего преаналитического этапа перед разработкой и внедрением исследования (например, путем проведения эксперимента или исследования для определения зависимости параметров от времени; см. также приложение A и ссылку [9]).

До фиксации тканей в стандартном забуференом растворе формалина количество белков может существенно изменяться в зависимости от продолжительности интракорпоральной ишемии, экстракорпорального хранения и температуры до фиксации в формалине (например, индукция или супрессия генов, деградация РНК). Кроме того, эти изменения могут варьировать в разных тканях пациентов/доноров.

Как правило, чем больше продолжительность интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения и чем выше температура окружающей среды до фиксации образца тканей, тем больше риск того, что может произойти изменение профиля белка.

Примечание - Длительное критическое хранение приводит к изменению количества белка (например, цитокератина 18) и фосфопротеина (например, фосфо-р42/44) [3]. Хранение образца на льду уменьшает этот эффект. Количество белка, а также модификации белка могут варьировать в зависимости от происхождения и типа ткани, основного заболевания, хирургической процедуры, лекарственного режима и препаратов, вводимых для анастезии или лечения сопутствующего заболевания, а также от различных условий окружающей среды после удаления ткани из организма.

Поскольку интракорпоральную ишемию сложно стандартизировать, ее продолжительность должна быть задокументирована. Когда невозможно избежать экстракорпорального хранения (например, транспортировка в лабораторию до фиксации формалином), его продолжительность должна быть задокументирована; температура окружающей среды контейнера также должна быть документирована. Если образец транспортируют в другое учреждение в нефиксированном виде, то должны быть задокументированы дата и время взятия, продолжительность и условия транспортирования.

Кроме того, сама фиксация ткани в формалине, а также последующая продолжительность и температура хранения парафиновых блоков вызывают модификации биомолекул и приводят к неоптимальным аналитическим характеристикам тестирования белков, выделенных из тканей в парафиновых блоках (FFPE). Это следует учитывать при контроле качества и применении молекулярно-биологических аналитических тестов. Оптимизация аналитических тестов для тканей в парафиновых блоках (FFPE) или использование не образующих поперечных связей альтернатив стандартному забуференному раствору формалина являются вариантами минимизации этой проблемы для молекулярно-биологических исследований.

Инструкции по технике безопасности при транспортировке и обработке должны рассматриваться и соблюдаться в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.2.3 и 5.4.5, а также ИСО 15190.

На преаналитическом этапе исследования должны быть приняты меры предосторожности, чтобы избежать перекрестной контаминации между различными образцами, например, путем использования одноразовых расходных материалов (пластика), когда это возможно, или применения соответствующих процедур деконтаминации между этапами обработки различных образцов.

Если медицинское изделие для диагностики in vitro, изготавливаемое в промышленных условиях и находящееся в обращении, не используется в соответствии с инструкциями производителя, ответственность за его использование и эксплуатационные характеристики возлагается на пользователя.

5 Внелабораторная преаналитика

5.1 Сбор образцов

5.1.1 Общие положения

При взятии образца следует учитывать требования (например, особенности заболевания, размер образца) для предполагаемого молекулярного исследования (также см. раздел 6).

См. также ИСО 15189:2012 (пункт 5.4.4).

5.1.2 Информация о доноре/пациенте

Документация должна содержать идентификационный номер, который может быть представлен в виде кода. А также включать в себя, но не ограничиваться:

a) соответствующим состоянием здоровья пациента/донора (например, здоровый, тип заболевания, сопутствующие болезни, демографические данные [например, возраст и пол]);

b) информацией о плановом медицинском лечении и специальной подготовке перед забором тканей (например, анестетики, медикаменты, хирургические или диагностические процедуры);

c) соответствующим согласием от пациента/донора образца.

5.1.3 Информация об образце

Документация должна включать в себя, но не ограничиваться:

a) в отношении интракорпоральной ишемии - временем в период оперативного вмешательства от момента перевязки/пережатия сосудов (обычно время пережатия артерии) до извлечения ткани из организма;

b) временем и датой удаления ткани из организма и способом ее удаления (например, толстоигольная биопсия, резекция, медицинское изделие, используемое для биопсии);

c) описанием типа и происхождения ткани, состоянием ткани (например, больной, незатронутый болезнью), включая ссылки на любую маркировку, нанесенную хирургом, рентгенологом или патологом в операционной или за ее пределами;

d) этапами документирования, описанными в 6.2, если фиксация формалином начинается вне лаборатории, а также этапами документирования, описанными в 6.3, если макроскопическая оценка образца и отбор образца(ов) (вырезка) также производится вне лаборатории.

В документации также должно быть указано лицо, ответственное за сбор образцов*.

________________

* Лицо, ответственное за обеспечение наличия контейнера и фиксирующего раствора, маркировку и транспортирование образцов в патологоанатомическое отделение.

5.1.4 Обработка образцов

Необходимо выполнить следующие действия:

a) документально зафиксировать любое добавление или изменение образца после удаления из тела (например, маркировка для ориентации образца [например, маркировка чернилами, швы, надрез(ы)]);

b) выбрать тип контейнеров и упаковок (например, термоконтейнер, коробка для хранения и транспортирования, вакуумная упаковка) в соответствии с применяемыми правилами перевозки;

c) выбрать и использовать процедуры по стабилизации (например, методы охлаждения) для транспортировки;

Примечание 1 - Случайное замораживание ткани (например, при неправильном использовании способов охлаждения) может привести к деградации белка при последующем размораживании ткани. Это также может повлиять на морфологическую характеристику.

Примечание 2 - Эта процедура может быть пропущена, если образец переносят непосредственно в стандартный забуференный раствор формалина (см. 6.2) и следует обратить внимание на важность объема фиксатора и для обеспечения пропитки ткани фиксатором.

d) промаркировать контейнер [например, регистрационный номер, штрих-код (1D или 2D), тип образца, количество и ткань органа происхождения] и дополнительно задокументировать [информация, указанная в 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4 a)-c)].

Несколько образцов от одного и того же пациента/донора, имеющих сходные характеристики (макроскопический вид, тип ткани, характер заболевания и анатомическое расположение), могут быть размещены в одном контейнере/отделе контейнера.

В образцы должны быть без промедления перенесены в контейнер после удаления из тела. Контейнер следует хранить на влажном льду или при температуре от 2°С до 8°С, чтобы свести к минимуму изменения профиля белка.

Температура окружающей среды контейнера во время экстракорпорального хранения (например, температура в разных помещениях, транспортирование) должна быть задокументирована. Если температура не может быть измерена, то диапазон температур должен быть оценен по классификации как температура окружающей среды, комнатная температура или от 2°С до 8°С.

5.2 Требования к транспортированию образца

Лаборатория в сотрудничестве с клиническим или хирургическим отделением на основе имеющейся процедуры разрабатывает и согласовывает протокол* транспортирования образца.

________________

* Дополнительная информация к стандартной операционной процедуре по транспортированию образцов.

Контроль температуры должен применяться соответствующим образом.

Если образец еще не помещен в стандартный забуференный раствор формалина, его следует без промедления транспортировать на влажном льду или при температуре от 2°С до 8°С, чтобы свести к минимуму изменения в профиле белка.

Примечание - Имеются данные о том, что стабилизация профилей белка в тканях на влажном льду может быть улучшена в будущем при использовании вакуумных пластиковых пакетов [15].

Если образец уже помещен в стандартный забуференный раствор формалина вне лаборатории, то температура во время транспортировки не должна превышать комнатную.

Соответствие условий транспортирования разработанному протоколу оформляется документально. Любые отклонения от протокола должны быть задокументированы.

6 Внутрилабораторная преаналитика

6.1 Информация о приеме образца

При приеме образца должны быть задокументированы: фамилия, имя, (отчество) лица, принявшего образец; дата и время доставки образца, а также его состояние (в частности, маркировка, условия транспортирования, включая температуру, вид ткани и количество образцов (фрагментов), нарушение целостности упаковки) при получении. Любое отклонение от разработанного протокола транспортирования (см. 5.2) должно быть задокументировано.

Правильность маркировки образца должна быть проверена. Маркировка должна включать в себя клиническую информацию (см. 5.1.1 и 5.1.3) об образце, номер медицинской карты (истории болезни) и/или идентификационный номер образца, имя пациента, дату рождения пациента.

6.2 Фиксация образцов формалином

Эта процедура применима к образцу, и в случае, если отобраны несколько фрагментов образца, то ко всему первичному образцу.

В качестве фиксатора используют стандартный забуференный раствор формалина.

Примечание 1 - В некоторых странах стандартный забуференный раствор формалина называют нейтральным забуференным формалином (NBF).

Примечание 2 - Существуют данные, подтвержденные Вестерн-блоттингом, о том что используемая для ускорения фиксации ультразвуковая обработка тканей увеличивает выход для некоторых белков [14].

Значение рН стандартного забуференного раствора формалина следует проверять не реже одного раза в неделю и перед использованием или в начале использования каждой новой партии, так как формалин не стабилен (например, формальдегид имеет тенденцию к окислению до муравьиной кислоты) [15].

Необходимо выполнить следующие действия:

a) ознакомиться с требованиями по технике безопасности и паспортом безопасности (SDS) при обращении со стандартным забуференным раствором формалина;

Примечание - Формальдегид является канцерогенным и опасным веществом, которое проникает в ткани и химически модифицирует биомолекулы. Однако могут существовать различные классификации в его отношении в разных странах.

b) задокументировать момент времени помещения образца ткани или части образца в забуференный раствор формалина;

Примечание - Общая продолжительность фиксации формалином может оказать влияние на дальнейшие исследования, например иммуногистохимические методы, а также молекулярно-биологические исследования нуклеиновых кислот. Оптимальная продолжительность фиксации формалином может варьироваться в зависимости от вида и размера ткани. Для больших фрагментов органов, полученных в ходе оперативных вмешательств, например, резекции желудка, до начала процесса макроскопического исследования может произойти неравномерная фиксация по причине медленного проникновения формальдегида с поверхности внутрь ткани. Фиксация формалином в течение более чем 24 ч может привести к интенсивному сшиванию, которое может повлиять на результаты исследования белка. Было показано, что выход белка снижается с увеличением продолжительности фиксации.

Пример - Для кусочков ткани толщиной 5 мм продолжительность фиксации составляет от 12 до 24 ч, обеспечивая надлежащее проникновение и фиксацию. См. также 6.7.2.

c) выбор контейнера(ов):

1) вместительность контейнера должна быть такой, чтобы образец можно было полностью погрузить в стандартный забуференный раствор формалина. Минимальное стандартное соотношение забуференный раствора формалина к ткани зависит от исследуемой ткани, но должно быть не менее 10:1 (объем к объему). Для обеспечения полной фиксации в формалине более крупных фрагментов следует выполнить специальную обработку тканей, такую как разрез (разрезы) солидных органов или выскрытие полых органов.

Более крупные образцы, возможно, потребуется разделить пополам и выбрать соответствующие части для обеспечения надлежащего проникновения фиксатора. В этом случае стандартный забуференный раствор периодически меняют*,

________________

* Замена раствора не менее одного раза в 10-12 ч.

2) при использовании контейнеров, предварительно заполненных стандартным буферным формалином, необходимо соблюдать инструкцию по применению продукта от производителя,

3) контейнер должен обеспечивать надежное закрытие;

d) промаркировать контейнер [например, с использованием самоклеящихся этикеток, рукописного текста, RFID-меток (транспондеров), использующих радиочастотные сигналы, предварительно маркированных контейнеров, штрих-кодов], чтобы должным образом обеспечивать надлежащую прослеживаемость образцов. А именно маркировка контейнера должна содержать минимальную информацию:

1) идентификатор (ФИО) пациента/донора, идентификация образца, дату взятия образца; информация может быть представлена в виде уникального идентификатора (кода) для каждого(й) образца,

2) основную информацию об образце, например, вид ткани, состояние ткани и связанную с этим дополнительную информацию - такую, как поражена ли ткань (например, опухолью) или нет, если только система отслеживания не может предоставить эту информацию в сочетании с идентификацией образца, использованной в перечислении 6.2 d) 1),

3) уникальную нумерацию каждого контейнера, которая может быть включена в перечисление 6.2 d) 1);

e) документация о типах, количестве и описании образцов или частях образца.

Следует учитывать, что при некоторых патологических состояниях, таких как опухоли, молекулярные признаки могут присутствовать в образце ткани неравномерно. Поэтому важно, чтобы фрагмент исследуемого образца ткани, используемый для молекулярно-биологического исследования, был оценен патологоанатомом (см. 6.3). В данной ситуации следует задокументировать, какие особенности заболевания на самом деле отражены в образце ткани, используемом для молекулярно-биологического исследования (например, разные молекулярные механизмы могут быть активированы в центре и в области прорастания опухоли, а также опухоли могут состоять из участков с различной степенью дифференцировки).

6.3 Оценка патологических изменений в образце и выбор фрагментов образца

Оценка и внесение в протокол информации о патологических изменениях в ткани и выбор образца(ов) в процессе вырезки для дальнейшего исследования должна осуществляться квалифицированным патологоанатомом или другим врачом под непосредственным наблюдением и ответственностью патологоанатома.

Могут применяться местные или национальные правила.

Варианты выбора фрагментов образца(ов) для исследования белка:

a) выбор подходящих фрагментов образца для гистопатологических и молекулярных исследований, а также для дальнейших исследовательских целей должен осуществляться или под контролем квалифицированного патологоанатома для обеспечения того, чтобы отбор образцов для исследования белка не ставил под угрозу гистопатологическое исследование. Для молекулярно-биологического исследования следует выбирать подходящие фрагменты ткани, по возможности избегая потенциально кровоточащих и некротических участков. При определенных особенностях заболевания на клеточном уровне в качестве выбора или дополнения должна быть использована микродиссекция.

Примечание 1 - В зависимости от разработанных стандартных процедур* выбор соответствующих фрагментов образца также может проводиться вне лаборатории, например, в операционной (см. пункт 5.1.3)**.

________________

* В соответствии с ГОСТ Р ИСО 15189 в лаборатории должны быть разработаны и задокументированы стандартные процедуры.

** В Российской Федерации вырезку фрагментов из образцов тканей проводят в специально приспособленных для этих целей помещениях патологоанатомического отделения.

В рамках макроскопической оценки образца ткани, взятого при хирургическом вмешательстве, до и/или после фиксации формалином, должна быть проверена клиническая информация (см. 5.1.2 и 5.1.3) об образце (например, вид, размер, количество фрагментов), а также номер истории болезни (медицинской карты) и/или номер исследования и/или ФИО пациента, дата рождения пациента и вид ткани. Образец ткани и все полученные результаты должны быть описаны надлежащим образом в соответствии с клиническими рекомендациями профильных медицинских ассоциаций (обществ), например, общества патологоанатомов, и в соответствии с клинической информацией и вопросами, например, записью о пациенте или запросом клинициста. Должна быть описана анатомическая локализация исследуемого образца, объем оперативного вмешательства и другие важные моменты, если это необходимо и полезно для последующей микроскопической оценки; могут быть сделаны фотографии. Для микроскопического исследования при вырезке должны быть взяты репрезентативные фрагменты ткани в соответствии с клиническими рекомендациями профильных медицинских ассоциаций (обществ) по исследованию конкретных органов/заболеваний.

Примечание 2 - Вышеописанная оценка или документация могут быть также выполнены вне лаборатории, например в операционной;

b) если образец ткани был удален из тела без необходимости последующего проведения гистологической диагностики, то составление сопроводительной документации на этот образец, а также оценка, выбор и описание его фрагментов кроме патологоанатомов могут проводить другие квалифицированные медицинские специалисты.

Время, когда фрагмент, взятый из образца, переносится в гистологическую кассету, должно быть задокументировано.

Без промедления образец помещают либо в стандартный забуферный раствор формалина, либо, если он уже зафиксирован, в спиртосодержащий раствор (например, 70%-ный этанол) для дальнейшей заливки в парафин.

Общая продолжительность фиксации формалином и температура в процессе фиксации должны быть задокументированы.

6.4 Постфиксация замороженных образцов

Замороженные образцы или фрагменты образца (например, после срочного интраоперационного исследования с использованием криостата) могут быть в последующем фиксированы в стандартном забуференном растворе формалина для дальнейшей заливки в парафин.

В этом случае общая продолжительность фиксации формалином должна быть задокументирована.

В случае, когда ткань в парафиновом блоке была получена из предварительно замороженного образца, это должно быть задокументировано.

6.5 Процесс заливки в парафин

После фиксации образца или его фрагмента в стандартном забуференном растворе формалина образец помещают в спиртосодержащий раствор гистологического процессора; этот этап должен быть задокументирован, отмечено время, когда происходит помещение в спиртосодержащий раствор гистологического процессора. Дальнейшая обработка должна проводиться в гистологическом процессоре в соответствии с требованиями инструкций производителя.

Примечание 1 - Во время обработки ткань обезвоживается, при этом вода заменяется парафином. Остаточная вода может влиять на качество и стабильность тканей, в том числе белков, при хранении [17].

Замена всех реагентов должна проводиться на регулярной основе в соответствии с инструкциями производителя.

Продолжительность и температура пропитки парафином могут влиять на целостность биомолекул в фиксированной ткани. Для фильтрации тканей следует использовать парафин с установленным в локальных процедурах составом и низкой температурой плавления. Продолжительность и температура каждого этапа заключения должны определяться в соответствии с инструкциями производителя или СОП (стандартной операционной процедурой), утвержденной в лаборатории.

Примечание 2 - Оптимальные температуры плавления парафина находятся в диапазоне от 50°С до 56°С.

Сам парафин и процедура заливки в парафин могут оказывать влияние на качество белков, особенно при использовании высоких температур и продолжительностей процесса заливки. В силу этого тест, выполняющий исследование белка, должен быть отвалидирован и проверен для процессов размещения в парафине. Если установлено воздействие на исследовательский тест, то температура и/или продолжительность должны быть уменьшены.

6.6 Требования к хранению

Ткани в парафиновых блоках (FFPE) могут храниться в нескольких видах, например, как блоки, срезы или тканевые микрочипы. Время хранения может влиять на извлечение белка или группы белков и тем самым повлиять на последующие протеомные изменения. В отличии от гистологии, результаты которой мало зависят от хранения, выход белка может уменьшаться из-за увеличенного срока хранения, особенно если образцы хранятся в течение многих лет.

Условия хранения, например, влажность и температура, могут оказывать влияние на качество белка в архивной ткани в парафиновых блоках (FFPE).

Примечание 1 - В одном исследовании приводятся данные о снижении сигнала вестерн-блоттинга белков, выделенных из участков тканей в парафиновых блоках (FFPE), в зависимости от температуры хранения и влажности.

Для того чтобы свести к минимуму изменение количества белка, ткань следует хранить в сухом помещении при комнатной температуре или предпочтительно при более низкой.

Примечание 2 - Более низкие температуры хранения (например, от 2°С до 8°С, минус 20°С) замедляют процесс деградации белка.

Примечание 3 - Если ткани в парафиновых блоках (FFPE) не хранятся в сухом виде, то деградация белка может увеличиться, что также может вызвать рост грибков и бактерий.

Для выделения белка срезы FFPE должны быть свежеприготовленными. Если хранения этих срезов невозможно избежать до выделения общего белка, то они должны храниться сухими и при комнатной или более низкой температуре в течение минимального срока.

Должна быть создана система для длительного хранения тканей в парафиновых блоках (FFPE). Место хранения, температура хранения и извлечение любого образца или его части из установленной системы хранения, его использование и возвращение в систему хранения должны быть задокументированы.

6.7 Выделение общего белка

6.7.1 Общие сведения

Гистологическая характеристика клеточного состава и патологического состояния образца или его фрагмента должна быть выполнена [например, на срезах с гематоксилином/эозином (H&E)] в соответствии с международной патологической классификацией (например, WHO/IARC Классификация Опухолей). Когда образец используется для молекулярной диагностики, часть целевых клеток-мишеней оценивается до выделения белка. Количество клеток-мишеней должно быть достаточным для проведения исследования. Когда образец используется не для диагностических целей, а, например, для научных исследований, следует применять тот же метод.

6.7.2 Общие сведения о процедурах выделения белка

Существует несколько проблем, включая селективное или неполное восстановление белков, деградацию белков и модификацию белков, которые должны приниматься во внимание при интерпретации результатов, полученных в результате исследований.

Требования и рекомендации:

a) оптимальная продолжительность фиксации зависит от типа и толщины ткани. Длительная фиксация тканей приводит к снижению выхода белка, и этого следует избегать. При толщине ткани до 5 мм продолжительность фиксации должна составлять от 12 до 24 ч в стандартном забуференном растворе формалина;

b) исходным материалом для выделения белка должны служить свежеприготовленные срезы парафиновых блоков толщиной до 10 мкм, полученные вручную на микротоме [21], с использованием лазерного микродиссектора или тканевые ядра [22] [например, тканевые микрочипы (ТМА)]. Лаборанты-гистологи должны носить перчатки. Соответствующие части микротома, включая многоразовое лезвие, должны быть очищены после резки каждого парафинового блока. Следует рассмотреть возможность использования новых одноразовых лезвий для микротома, чтобы избежать кросс-контаминации;

c) для идентификации, выбора и контроля извлечения фрагментов ткани из парафиновых блоков для последующего выделения и количественного определения белка следует использовать окрашенные гематоксилином/эозином (H&E) препараты стекол путем параллельного сравнения. Окрашивание участков перед выделением белка не должно выполняться, т.к. окрашивание может ухудшить качество белка и эффективность в последующих исследованиях.

Если белок выделяется из архивированных тканевых блоков, то блоки должны быть обрезаны путем удаления первых секций, прежде чем брать секции для выделения белка. Возможно, потребуется дополнительно обрезать блоки, чтобы дополнить их тканевыми компонентами для достоверности эксперимента.

Если имеются сомнения в правильности идентификации образца, то должна быть проведена проверка идентификации.

Выделение общего белка является ключевым этапом в диагностическом рабочем процессе, и этому этапу должно быть уделено особенное внимание при подтверждении и валидации всего рабочего процесса.

6.7.3 Использование промышленных наборов реагентов

При использовании наборов реагентов, находящихся в обращении*, предназначенных для выделения белка из тканей в парафиновых блоках, должны соблюдаться инструкции производителей.

__________________

* Допуском в обращение является выдача регистрационного удостоверения Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения.

6.7.4 Использование собственных лабораторных протоколов (методик)

Если промышленно выпускаемые наборы реагентов используют не по методике, указанной производителем, но методика для определенных целей пользователем валидирована, то должна быть подготовлена инструкция, которой необходимо следовать.

Если лаборатория использует свой собственный протокол (методику), не связанный с инструкцией производителя, то должна быть проведена валидация и верификация, подтверждающая, что методика пригодна для данных условий и применения для достижения поставленных целей, а также должны быть написаны и использованы инструкции пользователя.

Обработка сильным детергентом (чаще всего используется додецилсульфат натрия, SDS) и воздействие высоких температур должны использоваться для эффективного удаления белковых сшивок, вызванных формальдегидом, что является необходимым для выделения белка из тканей в парафиновых блоках.

Использование наборов реагентов разных производителей может привести к ухудшению результатов, т.к. эти продукты могли бы быть несовместимы. Они должны использоваться для диагностического тестирования только тогда, когда совместное использование компонентов было проверено и показана их удовлетворительная работа.

Процедура выделения белка для срезов тканей в парафиновых блоках, которые закрепляются непосредственно на предметном стекле, должна содержать три следующих этапа:

a) подготовка образца или части образца:

- при помощи микротома следует нарезать подходящее количество срезов толщиной от 5 до 1 мк, а затем расположить их на предметном стекле микроскопа.

Примечание - Для некоторых тканей и/или белков также могут быть использованы срезы большей толщины;

b) депарафинизация:

- можно использовать обычные шаги депарафинизации и регидрации (например, добавление подходящего растворителя парафина дважды в течение 10 мин и 100%, 90% и 70% этанола каждые 5 мин).

Примечание - Это можно сделать с помощью растворителей, таких как ксилол. В качестве альтернатив могут быть использованы высокотемпературные методы, которые позволяют удалить парафин из тканей без применения растворителей;

c) выделение белка:

- необходимый участок среза ткани должен быть перенесен в реакционную пробирку, содержащую подходящий объем буфера для выделения белка, содержащего сильный детергент, например, додецилсульфат натрия. Срезы ткани кипятят в течение 20 мин с последующей инкубацией при температуре 80°С в течение 2 ч. Обработанные срезы должны быть отцентрифугированы и после всплытия перенесены в чистую реакционную пробирку для оценки качества,

- в зависимости от последующего аналитического теста (например, масс-спектометрия) дополнительные этапы (например, протеолиз) могут потребоваться после отмывки детергента,

- для выделения белков очень малого числа клеток, полученных при извлечении единичных клеток с помощью лазерной микродиссекции, могут потребоваться различные специальные процедуры выделения белков.

Примечание - Неполное растворение тканей из срезов, полученных из парафиновых блоков, может привести лицо, ответственное за обеспечение наличия контейнера и фиксирующего раствора, маркировку и транспортирование образцов в патологоанатомическое отделение, к смещению результатов из-за выделения и повлиять на результат.

6.8 Оценка качества выделенных белков

Качество и количество белка должно быть проверено с помощью общепринятых физических, химических и биохимических процедура (например, вестерн-блоттингом, методом Бредфорда) и/или соответствующими контрольными методами в рамках теста.

Такие процедуры для определения чистоты и целостности могут включать в себя один или несколько следующих методов, в зависимости от специфики исследования:

a) электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и окрашивание синим Кумасси и серебром;

b) капиллярный электрофорез;

c) масс-спектометрия;

d) вестерн-блот (например, бета-актин).

Определение общей концентрации белка может включать в себя один или несколько из нижеследующих методов, в зависимости от специфики исследования:

a) метод Бредфорда;

b) анализ бицинхониновой кислоты (ВСА);

c) метод Лоури.

6.9 Хранение выделенного общего белка

Необходимо следовать специальным инструкциям для хранения выделенного белка, указанным в документации производителя набора для выделения. Там, где инструкции производителя теста для исследования являются более строгими, чем конкретные инструкции, предоставляемые производителем набора для выделения белка, например используется более низкая температура, инструкции производителя теста для исследования должны быть соблюдены.

Если нет никакой информации от производителя набора для выделения белков или если используются собственные валидированные процедуры по выделению белков в лаборатории, то выделенные белки должны быть немедленно проанализированы. В тех случаях, когда белок не может быть проанализирован немедленно, лаборатория должна иметь валидированные процедуры по его хранению.

Примечание 1 - Хранение на влажном льду в течение короткого периода времени (например, 2 ч) может быть целесообразным в определенных обстоятельствах.

Хранение на длительный срок (т.е. в течение нескольких лет) должно быть при температуре ниже минус 70°С. Также могут быть использованы другие утвержденные методы для архивного хранения.

При длительном хранении выделенный белок должен быть разделен на аликвоты, во избежание повторного замораживания-размораживания. Следует избегать более чем двух циклов замораживания-оттаивания. При лиофилизации белки могут храниться в течение нескольких лет от 4°С до минус 20°С.

Примечание 2 - На стабильность белка влияют такие факторы, как циклы замораживания/оттаивания, рН, концентрация белка, солевые условия и другие. Оптимальные условия для хранения конкретных белков могут варьироваться от белка к белку.

Следует избегать непреднамеренной сублимационной сушки выделенного белка при длительном хранении из-за испарения воды, т.к. белки могут деградировать и извлечение из пробирки для хранения может быть затруднено или даже невозможно. Поэтому следует использовать соответствующие емкости для хранения, такие как криогенные флаконы, чтобы избежать испарения воды при хранении, их тип и тип крышек должны быть задокументированы.

Для длительного хранения должен применяться валидированный процесс организации и уникальной маркировки пробирок для хранения, содержащего в себе выделенный белок или аликвоты, полученные из него.

Должна быть обеспечена прослеживаемость, например, с помощью считываемых RFID, ID- или 2D-штрих-кодов или предварительно промытых емкостей для хранения с уникальными кодами, предоставленными производителями, пригодными для низкотемпературного хранения.

Приложение А

(справочное)

Исследование белка, демонстрирующее изменение его количества во время экстракорпорального хранения

А.1 Введение

Фосфорилирование и дефосфорилирование являются ключевыми механизмами внутри- и межклеточной передачи сигналов и отражают состояние активации клетки. Идентификацию специфических профилей фосфорилирования белков используют для разработки таргетных терапий при нарушении регуляции сигнальных путей у онкологических больных. Однако знания о влиянии преаналитического этапа, таких его компонентов как время задержки перед фиксацией образца формалином, на изменения белкового состава образца, фосфорилирования белков в образце очень ограничены.

Результаты данного исследования дают представление о межпациентной вариабельности, а также о флуктуациях в профилях белков и профилях фософорилирования белков в клинических образцах тканей в ходе проведения преаналитического этапа. С помощью тканей кишечника человека и печени в качестве примеров данные этой экспериментальной работы, как описано ниже, четко показывают, что существует необходимость стандартизации шагов сбора фиксированных в парафиновых блоках (FFPE) тканей и последующего выделения, хранения белков и фосфорилированных белков до количественного исследования. Этот процесс стандартизации включает в себя документирование продолжительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения. В то время как результаты для интракорпоральной ишемии представлены в другом месте (смотрите дополнительную литературу), приведенные здесь данные указывают на то, что экстракорпоральное хранение оказывает влияние на белковые профили. Таким образом, существует риск того, что из-за различий в продолжительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения и других параметров предварительного обследования анализ исследования может оказаться ненадежным и значимые биомаркеры для лечения пациентов могут быть пропущены или истолкованы неверно.

А.2 Пример

А.2.1 Общие сведения

В эксперименте по исследованию времени хранения ткани кишечника и печени человека использовали для оценки влияния длительного экстракорпорального хранения на количество белков и фосфопротеинов в образцах до фиксации в формалине. Полученные данные показали, что количество белка и фосфопротеина изменяется до того, как ткани стабилизируются при помощи фиксации стандартным забуференным раствором формалина.

А.2.2 Экспериментальные процедуры

А.2.2.1 Общие сведения

Рисунок А.1 - Обзор сбора тканей

А.2.2.2 Ткани

А.2.2.3 Исследование белков

Как референсные методы анализа количества отдельных белков и некоторых фосфорилированных белков применялись метод обращенно-фазового микроматричного анализа белков (RPPA) и вестерн-блоттинг. Использованные антитела приведены в таблице А.1.

Таблица А.1 - Антитела, использованные для анализа с применением RPPA и вестерн-блоттинга

A.2.3 Результаты

Для изучения влияния продолжительности экстракорпорального хранения на белковые профили собрали образцы доброкачественных тканей человека (n=11). Образцы были получены во время рутинных хирургических операций и доставлены в лабораторию, где с ними провели контролируемые во времени эксперименты. После выделения белка стабильность выбранных белков количественно исследовали методом обращенно-фазового микроматричного анализа белков (RPPA) с 23 специфическими антителами, семь из которых были нацелены на фосфорилированные эпитопы, один из них - на распознавание расщепленного белка. Белки отобрали на основе их потенциального участия в важнейших клеточных функциях или сигнальных путях, таких как стуктура клетки, пролиферация и выживание, реакция на стресс, гипоксия, апоптоз и адгезия. Анализируя расщепление белка и посттрансляционные модификации (фосфорилирование), можно достоверно определить потенциальные флуктуации количества общего и фосфорилированного белка во время хранения.

X - время (мин); Y - изменение относительной интенсивности

Рисунок А.2 - Исследование белков и фосфопротеинов при экспериментально отсроченном воздействии экстракорпорального хранения

А.3 Выводы

Результаты настоящего исследования позволяют получить представление о вариативности между разными пациентами, а также о колебаниях белкового и фосфопротеинового профилей в клинических образцах тканей на преаналитическом этапе. Данные этой экспериментальные работы наглядно показывают, что существует необходимость стандартизации сбора тканей в парафиновых блоках (FFPE), последующее выделение и хранение белков и фосфопротеинов перед количественным исследованием. Этот процесс стандартизации включает в себя документирование продолжительности интракорпоральной ишемии и экстрокорпорального хранения. В то время как результаты для интракорпоральной ишемии представлены в других источниках (см. дополнительную литературу), приведенные здесь данные указывают на то, что экстрокорпоральное хранение оказывает влияние на белковые профили. Таким образом, существует риск того, что из-за различий в продолжительности интракорпоральной ишемии и экстрокорпорального храненияи других параметров на этапе подготовки к исследованию результаты исследования могут быть ненадежными, а значимые биомаркеры для лечения пациентов - пропущены или неправильно интерпретированы.

А.4 Дополнительная литература

Giindisch S., Hauck S., Sarioglu H., Schott С. et al. Вариативность уровней белка и фосфопротеина в клинических образцах тканей на преаналитическом этапе исследования. "Журнал исследований протеома", 2012, дек. 7; 11(12):5748-62.

Стандартизация и совершенствование общих преаналитических инструментов и процедур для диагностики in vitro www.spidia.eu

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография