ГОСТ 34678-2020 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

ГОСТ 34678-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Food products, food raw materials. Method for determination of the residual content of polypeptide antibiotics by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

МКС 67.050

67.100

67.120.10

67.120.20

Дата введения 2021-03-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 31 августа 2020 г. N 132-П)

За принятие проголосовали:

(Поправка. ИУС N 2-2021), (Поправка. ИУС N 9-2022).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 7 октября 2020 г. N 753-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34678-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 марта 2021 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

ВНЕСЕНЫ: поправка, опубликованная в ИУС N 2, 2021 год; поправка, опубликованная в ИУС N 9, 2022 год

Поправки внесены изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и продовольственное сырье: мясо (животных всех видов), в том числе мясо птицы, субпродукты, мясные продукты, полуфабрикаты, молоко, молочные продукты, сыр, яйца, яичные продукты и устанавливает метод определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Диапазон измерений для бацитрацина А, колистина А, полимиксина В1, виргиниамицина S1, виргиниамицина М1, актиномицина D, новобиоцина - от 5 до 500 мкг/кг, для колистина В - от 3,75 до 375,00 мкг/кг, для полимиксина В2 - от 2,5 до 250,0 мкг/кг, для бацитрацина В - от 1 до 100 мкг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.2.085 Арматура трубопроводная. Клапаны предохранительные. Выбор и расчет пропускной способности

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4025 Мясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 5848 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 7269 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9792 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 20469 Электромясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 22300 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29245-91 Консервы молочные. Методы определения физических и органолептических показателей

ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 31654 Яйца куриные пищевые. Технические условия

ГОСТ 31720 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы отбора проб и органолептического анализа

ГОСТ ИСО 5725-6-2003** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике*

________________

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

** Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Метод основан на извлечении полипептидных антибиотиков из анализируемой пробы подкисленным водно-метанольным раствором с последующей очисткой методом твердофазной экстракции. Идентификацию и количественное определение полипептидных антибиотиков проводят по площадям пиков ион-продуктов с использованием градуировочной характеристики, полученной при анализе матричных градуировочных растворов, методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

4 Требования безопасности и условия выполнения измерений

4.1 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности, при работе с ними необходимо соблюдать общие требования безопасности обращения с вредными веществами, установленные ГОСТ 12.1.007. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

4.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021 и защищены от действия прямого солнечного или ультрафиолетового излучения.

4.3 Приготовление и использование градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу при включенной вентиляции.

4.4 При проведении испытаний соблюдают правила безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, по ГОСТ 12.2.085.

4.5 При работе с электроприборами следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019, пожаровзрывобезопасности - ГОСТ 12.1.018 и инструкции по эксплуатации приборов.

4.6 К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих высшее специальное образование, прошедших соответствующий инструктаж, владеющих техникой хромато-масс-спектрометрии и изучивших инструкции по эксплуатации используемых приборов.

4.7 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха - от 15°С до 25°С;

- относительная влажность воздуха - от 20% до 80%.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

5.1 Для определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду:

- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности взвешивания не более ±0,03 г;

- весы специального (I) класса точности с пределами допускаемой погрешности взвешивания не более ±0,3 мг;

- масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации с электрораспылением, квадрупольными анализаторами диапазоном измерений от 50 до 900 атомных единиц массы (а.е.м.), с массовым разрешением не менее 1 а.е.м., с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,5 а.е.м., режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

- систему высокоэффективной жидкостной хроматографии, оснащенную бинарным насосом со смесителем и термостатом хроматографической колонки, обеспечивающим температуру нагрева до (50±1)°С;

- колонку хроматографическую, заполненную обращенно-фазным сорбентом С18 с диаметром частиц не более 5,0 мкм, длиной не менее 150 мм;

- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

- дозаторы механические одноканальные переменной вместимостью 10-100, 100-1000 мм, 1-5 см с допустимой относительной погрешностью дозирования не более ±2,5%;

- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и температурой термостатирования от 10°С до 200°С;

- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

- картриджи для твердофазной экстракции* вместимостью не менее 6 см, заполненные сорбентом на основе сополимера дивинилбензола и винилпирролидона с частицами диаметром не более 50 мкм, массой 200 мг;

________________

* Например, модели Waters Oasis HLВ, Waters. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других моделей с аналогичными характеристиками.

- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм;

- баню водяную лабораторную с диапазоном поддержания температуры от 5°С до 100°С;

- встряхиватель (шейкер) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм, диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4500 об/мин и диапазоном температур охлаждения от 4°С до 20°С с адаптерами для пробирок вместимостью 15 и 50 см;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 15000 об/мин и диапазоном температур охлаждения от 4°С до 20°С с адаптером для пробирок вместимостью 1,5 см;

- измельчитель-гомогенизатор погружного типа;

- мясорубку бытовую по ГОСТ 4025 или электромясорубку по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки не более 4 мм;

- систему получения деионизированной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм·см;

- камеру лабораторную морозильную с рабочим диапазоном температур от минус 15°С до минус 25°С;

- холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2°С до 8°С;

- пробы, не содержащие полипептидные антибиотики, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8, в зависимости от типа исследуемой матрицы ("чистые пробы"*);

________________

* Срок хранения "чистых проб" при температуре от минус 15°С до минус 25°С - не более 3 мес.

- шкаф сушильный с максимальной температурой нагрева не менее 110°С и с погрешностью поддержания заданной температуры ±5°С;

- фильтры нейлоновые мембранные с диаметром пор не более 0,2 мкм;

- пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см с навинчиваемыми крышками;

- пробирки микроцентрифужные полипропиленовые вместимостью 1,5 см;

- виалы (флаконы) для автоматического устройства ввода проб вместимостью 2 см с навинчиваемыми крышками и тефлоновыми прокладками диаметром 9 мм;

- колбы мерные с пришлифованными пробками 2-100(500) по ГОСТ 1770;

- колбы мерные 1-10(1000)-2 по ГОСТ 1770;

- колбы П-1-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336;

- цилиндры 1-50(500, 1000)-2 по ГОСТ 1770;

- бутыль с горловиной под крышку с винтовой резьбой вместимостью 1000 см.

5.2 При определении содержания полипептидных антибиотиков применяют следующие реактивы:

- метанол для ВЭЖХ, х.ч.;

- кислоту муравьиную по ГОСТ 5848, ч.д.а.;

- кислоту серную по ГОСТ 4204, х.ч.;

- воду деионизированную для ВЭЖХ;

- азот газообразный марки 60 по ГОСТ 9293, ос.ч.;

- ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а.;

- эфир этиловый уксусной кислоты (этилацетат) по ГОСТ 22300, ч.д.а.

5.3 При определении содержания полипептидных антибиотиков в качестве образцов сравнения применяют следующие соединения с массовой долей основного вещества:

- бацитрацин (бацитрацина А не менее 67,5%, бацитрацина В не менее 14,0%), CAS 1405-87-4;

- колистина сульфат (колистина А не менее 44,6%, колистина В не менее 33,2%), CAS 1264-72-8;

- полимиксина B сульфат (полимиксин B1 не менее 50%, полимиксин B2 не менее 25%), CAS 1405-20-5;

- виргиниамицин S1 с массовой долей основного вещества не менее 90%, CAS 23152-29-6;

- виргиниамицин М1 с массовой долей основного вещества не менее 90%, CAS 21411-53-0;

- актиномицин D с массовой долей основного вещества не менее 90%, CAS 50-76-0;

- новобиоцина натриевая соль с массовой долей основного вещества не менее 90%, CAS 1476-53-5.

5.4 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.

6.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

6.1.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105°С до 110°С.

6.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.

6.2 Приготовление растворов

6.2.1 Приготовление подвижных фаз А и Б

6.2.1.1 Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см приливают 900 см деионизированной воды и добавляют 5 см муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора до метки на колбе деионизированной водой.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 1 мес.

6.2.1.2 Для приготовления подвижной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см приливают примерно 900 см метанола и добавляют 5 см муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора до метки на колбе метанолом.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 1 мес.

6.2.2 Приготовление смеси метанола и деионизированной воды в объемном соотношении 5:4

В стеклянную бутыль вместимостью 1000 см вносят 500 см метанола и 400 см деионизированной воды, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 3 мес.

6.2.3 Приготовление 0,5%-ного раствора муравьиной кислоты в метаноле

В мерную колбу вместимостью 500 см приливают 450 см метанола, добавляют 2,5 см муравьиной кислоты, доводят объем раствора до метки на колбе метанолом и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 1 мес.

6.2.4 Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрацией 5 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 50 см деионизированной воды, осторожно добавляют 28,5 см концентрированной серной кислоты. Доводят объем раствора до метки на колбе деионизированной водой и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 3 мес.

6.2.5 Приготовление смеси метанола и деионизированной воды в объемном соотношении 1:9

В колбу вместимостью 500 см вносят 50 см метанола и 450 см деионизированной воды, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 3 мес.

6.2.6 Приготовление смеси метанола и деионизированной воды в объемном соотношении 1:1

В колбу вместимостью 500 см вносят 250 см метанола и 250 см деионизированной воды, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 3 мес.

6.2.7 Приготовление 0,05%-ного раствора муравьиной кислоты в смеси метанола и деионизированной воды с объемным соотношением 1:1

В колбу вместимостью 500 см вносят 499,75 см смеси метанола и деионизированной воды (см. 6.2.6), 0,25 см муравьиной кислоты и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15°С до 25°С - не более 3 мес.

6.3 Приготовление матричных градуировочных растворов

6.3.1 Приготовление исходных растворов полипептидных антибиотиков с массовыми концентрациями бацитрацина А, колистина А, полимиксина B1, виргиниамицина S1, виргиниамицина М1, актиномицина D, новобиоцина - 1 мг/см, бацитрацина B - 0,2 мг/см, колистина B - 0,75 мг/см, полимиксина B2 - 0,5 мг/см

Для приготовления исходных растворов в отдельные полипропиленовые пробирки вместимостью 15 см вносят по 4,0-6,0 мг каждого образца сравнения и добавляют соответствующие растворители, массу которых , мг, вычисляют по формуле

, (1)*

где - масса образца сравнения, г;

- молярная масса чистого вещества, г/моль;

- массовая доля основного вещества в образце сравнения, %;

- плотность растворителя, г/см;

- молярная масса аналита в солевой форме, г/моль;

- концентрация раствора аналита , г/см.

______________________

* Фомула и экспликация к ней соответствуют оригиналу. - .

Допускается приготовление растворов объемно-весовым методом.

Растворители для образцов сравнения полипептидных антибиотиков выбирают в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Плотность метанола , г/см, определяют в соответствии с таблицей 2, с учетом температуры окружающего воздуха в помещении.

Таблица 2

Для определения плотности смеси метанол/деионизированная вода (см. 6.2.6) и 0,05%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 6.2.7) в предварительно взвешенные мерные колбы вместимостью 10 см приливают по отдельности до меток вышеуказанные растворы, измеряют их массу и вычисляют плотность , г/см, по формуле

, (2)

где - масса смеси метанол/деионизированная вода (см. 6.2.6) или 0,05%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 6.2.7), г.

Срок хранения растворов при температуре от минус 15°С до минус 25°С - не более 6 мес.

Перед применением растворы выдерживают на водяной бане при температуре от 20°С до 22°С не менее 30 мин.

6.3.2 Приготовление рабочего раствора смеси определяемых аналитов

В мерную колбу вместимостью 10 см отбирают по 0,1 см каждого раствора , доводят объем раствора до метки метанолом и перемешивают.

Массовая концентрация бацитрацина А, колистина А, полимиксина B1, виргиниамицина S1, виргиниамицина М1, актиномицина D и новобиоцина в приготовленном растворе составляет 10 мкг/см.

Массовая концентрация бацитрацина B - 2 мкг/см, колистина B - 7,5 мкг/см, полимиксина B2 - 5 мкг/см.

Срок хранения раствора при температуре от минус 15°С до минус 25°С - не более 6 мес.

6.3.3 Приготовление рабочего раствора смеси определяемых аналитов

В мерную колбу вместимостью 10 см отбирают 1,0 см раствора , доводят объем раствора до метки метанолом и перемешивают.

Массовая концентрация бацитрацина А, колистина А, полимиксина B1, виргиниамицина S1, виргиниамицина М1, актиномицина D и новобиоцина в приготовленном растворе составляет 1 мкг/см.

Массовая концентрация бацитрацина B - 0,2 мкг/см, колистина B - 0,75 мкг/см, полимиксина B2 - 0,5 мкг/см.

Срок хранения раствора при температуре от минус 15°С до минус 25°С - не более 3 мес.

Перед применением растворы выдерживают на водяной бане при температуре от 20°С до 22°С в течение 30 мин.

6.3.4 Приготовление матричных градуировочных растворов

Матричные градуировочные растворы готовят в полипропиленовых пробирках вместимостью 50 см из "чистых проб" массой (5,0±0,05) г, в которые вносят 18 см смеси метанол/деионизированная вода в объемном соотношении 5:4 (см. 6.2.2), гомогенизируют погружным гомогенизатором, добавляют 2 см серной кислоты и вносят рабочие растворы смеси определяемых аналитов , в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3

Дальнейшую обработку матричных градуировочных растворов проводят в соответствии с 7.2.2 и 7.2.3.

Растворы используют свежеприготовленными.

Массовые концентрации полипептидных антибиотиков в матричных градуировочных растворах и приписанные им массовые доли аналитов в чистых образцах, в которые добавили рабочие растворы смеси определяемых аналитов или , представлены в таблицах 4 и 5 соответственно.

Таблица 4

Таблица 5

6.4 Построение градуировочной характеристики

6.4.1 Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с использованием программного обеспечения хромато-масс-спектрометрической системы.

6.4.2 Проводят измерения не менее четырех матричных градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.4, в порядке возрастания их концентраций. Если результат испытаний образца превышает верхнюю границу градуировочного графика по одному или нескольким аналитам, то данный образец следует переделать в следующей серии с дополнительной точкой градуировки. Определяют времена удерживания аналитов.

6.4.3 Вычисление площади пика проводят для каждого ион-продукта анализируемых соединений. Количественное определение полипептидных антибиотиков проводят по одному (наиболее интенсивному) ион-продукту.

6.4.4 Градуировочную характеристику строят в координатах "площадь пика определяемого соединения" - "концентрация определяемого соединения". При построении градуировочной характеристики используют линейную функцию вида y=а±bx, при этом квадрат коэффициента корреляции должен быть не менее 0,98.

Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново.

6.4.5 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации полипептидных антибиотиков в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.

7 Отбор, подготовка и обработка проб

7.1 Отбор проб

7.1.1 Отбор проб мяса, субпродуктов - по ГОСТ 7269.

7.1.2 Отбор проб мяса птицы, пищевых субпродуктов и полуфабрикатов из мяса птицы - по ГОСТ 31467.

7.1.3 Отбор проб колбасных изделий и продуктов из свинины, баранины, говядины, мяса других видов убойных животных и птиц - по ГОСТ 9792.

7.1.4 Отбор проб молока и молочных продуктов - по ГОСТ 26809.1, сыра - по ГОСТ 26809.2.

7.1.5 Отбор проб яиц - по ГОСТ 31654, жидких и сухих яичных продуктов - по ГОСТ 31720.

7.1.6 Пробы, отобранные по 7.1.1, 7.1.2, при отсутствии возможности анализа в день отбора замораживают и хранят при температуре от минус 15°С до минус 25°С до проведения анализа, но не более 90 сут.

7.2 Подготовка проб

7.2.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Мясо, субпродукты, мясные продукты измельчают на мясорубке дважды.

Подготовку мяса птицы, пищевых субпродуктов и полуфабрикатов из мяса птицы проводят по ГОСТ 31467-2012 (раздел 6).

Яйца отделяют от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе, жидкие и сухие яичные продукты тщательно перемешивают.

Подготовку проб молока и молочных продуктов проводят по ГОСТ 26809.1. Сухие молочные продукты восстанавливают по ГОСТ 29245-91 (пункт 3.4).

Подготовку проб сыра проводят по ГОСТ 26809.2.

7.2.2 Взвешивают (5,0±0,05) г подготовленной пробы в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см, вносят 18 см смеси метанол/деионизированная вода (см. 6.2.2) и гомогенизируют погружным гомогенизатором (тщательно промывают гомогенизатор после измельчения каждой пробы). Добавляют 2 см раствора серной кислоты (см. 6.2.4) и помещают в шейкер на 10 мин для перемешивания, затем центрифугируют со скоростью вращения 4500 об/мин при температуре 4°С в течение 15 мин.

Сливают надосадочный слой в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см и добавляют 18 см деионизированной воды.

Полученный экстракт очищают методом твердофазной экстракции по 7.2.3.

7.2.3 Картриджи для твердофазной экстракции предварительно кондиционируют, последовательно пропуская 5 см метанола и 5 см деионизированной воды (вакуум или избыточное давление не применяют). Затем пропускают через картридж экстракт, полученный в соответствии с 7.2.2. После этого картридж промывают два раза порциями по 4 см смеси метанол/деионизированная вода в объемном соотношении 1:9 (см. 6.2.5) и сушат под вакуумом в течение 5 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см с использованием 5 см раствора 0,5%-ной муравьиной кислоты в метаноле (см. 6.2.3). Упаривают элюат до 0,3-0,4 см в токе азота при температуре 40°С, добавляют 0,5 см подвижной фазы А, перемешивают и переносят в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку. Доводят объем раствора до метки 1 см подвижной фазой А и центрифугируют со скоростью вращения 15000 об/мин при температуре 4°С в течение 10 мин. Затем фильтруют через мембранный фильтр в виалу вместимостью 2 см и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

8 Порядок выполнения анализа

8.1 Условия хроматографического разделения

8.1.1 Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.

8.1.2 Например, для колонки длиной 150 мм с обращенно-фазным сорбентом С18 с размером частиц не более 5,0 мкм соблюдают следующие условия хроматографического анализа:

- температура колонки - 40°С;

- скорость потока подвижной фазы - 250 мм/мин;

- объем вводимой пробы - 15 мм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление подвижных фаз А и Б - по 6.2.1) в соответствии с таблицей 6.

Таблица 6 - Условия градиентного элюирования при регистрации положительных ионов

8.1.3 Общие параметры настройки масс-спектрометрического детектора:

- режим работы источника - ионизация электроспреем, ESI;

- напряжение на распыляющем капилляре (IS) - 5500 В при регистрации положительных ионов;

- температура источника - от 450°С до 500°С;

- разрешение квадруполей Q1/Q3 - единичное;

- давление газа для фрагментации (CAD) - 6 кПа.

8.1.4 Параметры мониторинга множественных реакций (MRM) в положительном режиме ионизации при измерении полипептидных антибиотиков приведены в таблице 7.

Таблица 7

Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.

8.1.5 Контроль чувствительности хромато-масс-спектрометра осуществляют введением в инжектор хроматографа 15 мм матричного градуировочного раствора (см. 6.3.5). Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 10.

8.2 ВЭЖХ-МС/МС измерение

8.2.1 Для измерения содержания полипептидных антибиотиков проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования. Для каждой пробы проводят два параллельных измерения.

8.2.2 Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:

- подвижную фазу А;

- "чистую пробу";

- матричные градуировочные растворы (см. 6.3.5);

- экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.

8.2.3 Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков двух ион-продуктов каждого аналита, которое должно соответствовать времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов.

9 Обработка результатов измерений

9.1 В соответствии с данными, полученными при измерении градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения массовой концентрации полипептидных антибиотиков в двух параллельных измерениях анализируемой пробы.

9.2 Содержание -го аналита , мкг/кг, представляют в виде

, (3)

где - массовая доля аналита в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику, мкг/кг.

9.3 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений анализируемой пробы, если выполняется условие приемлемости по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 5.2.2).

10 Метрологические характеристики

Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение определения содержания полипептидных антибиотиков с относительной расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата =2 и доверительной вероятности Р=0,95, указанной в таблицах 8-11.

Таблица 8 - Показатели точности метода при определении содержания полипептидных антибиотиков в субпродуктах

Таблица 9 - Показатели точности метода при определении содержания полипептидных антибиотиков в мясе (включая мясо птицы)

Таблица 10 - Показатели точности метода при определении содержания полипептидных антибиотиков в молоке и молочных продуктах

Таблица 11 - Показатели точности метода при определении содержания полипептидных антибиотиков в яйцах и яичных продуктах

11 Оформление результатов измерений

Содержание -го аналита, мкг/кг, представляют в виде

при Р=0,95, (4)

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений содержания -го аналита в анализируемой пробе, мкг/кг (см. 9.3);

- значение относительной расширенной неопределенности содержания -го аналита для соответствующего диапазона измерений, % (в соответствии с таблицами 8-11);

- значение расширенной неопределенности в абсолютных единицах, мкг/кг.

Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение расширенной неопределенности, содержащее не более трех значащих цифр и выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг).

12 Контроль стабильности результатов измерений

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 6.2.3) с использованием контрольных карт Шухарта.

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена