ГОСТ Р 56201-2014 Продукты пищевые функциональные. Методы определения бифидогенных свойств

ГОСТ Р 56201-2014

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

Методы определения бифидогенных свойств

Functional foods and foods for special dietary uses. Methods for the determination of bifidogenic properties *

________________

* Измененная редакция, Изм. N 1.

ОКС 67.220.20 *

67.050

________________

* Измененная редакция, Изм. N 1.

Дата введения 2016-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН коллективом специалистов Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научно-исследовательский институт питания" (ФГБНУ "НИИ питания")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 "Продукты пищевые специализированные"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 октября 2014 г. N 1471-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

ВНЕСЕНО Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28.01.2020 N 17-ст c 01.04.2020

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 4, 2020

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на специализированные и функциональные пищевые продукты и функциональные пищевые ингредиенты, обогащенные пробиотическими микроорганизмами или пребиотическими веществами (молочные продукты, молочные составные продукты, молокосодержащие продукты, безалкогольные напитки и биологически активные добавки к пище), и устанавливает методы определения бифидогенных свойств продуктов.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 3 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 245 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 490 Добавки пищевые. Кислота молочная Е270. Технические условия

ГОСТ 1129 Масло подсолнечное. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 2768 Ацетон технический. Технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4145 Реактивы. Калий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4159 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4162 Реактивы. Квасцы хромокалиевые. Технические условия

ГОСТ 4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4232 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4526 Реактивы. Магний оксид. Технические условия

ГОСТ 5538 Реактивы. Калий лимоннокислый 1-водный. Технические условия

ГОСТ 5556 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 5833 Реактивы. Сахароза. Технические условия

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6038 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия

ГОСТ 6292 Крупа рисовая. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7205 Реактивы. Марганец (II) углекислый основной, водный. Технические условия

ГОСТ 8927 Реактивы. Медь (II) углекислая основная. Технические условия

ГОСТ 9284 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9393 Жир ветеринарный из рыбы и морских млекопитающих. Технические условия

ГОСТ 9412 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 10444.1 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 10444.11 (ISO 15214:1998) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества мезофильных молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 10929 Реактивы. Водорода пероксид. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13646 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия

ГОСТ 13739 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 13805 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 16317 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17206 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 19881 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 20015 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 21239 (ИСО 7741-86) Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний

ГОСТ 21240 Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 21241 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 21400 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 22280 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 23932 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 24363 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26670 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 27547 Витамин Е (-токоферола ацетат) микрогранулированный кормовой. Технические условия

ГОСТ 27987 Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия

ГОСТ 28489 Микроскопы световые. Термины и определения

ГОСТ 28566 Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31598 (EN 285:1996) Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 31654 Яйца куриные пищевые. Технические условия

ГОСТ 31689 Казеин. Технические условия

ГОСТ 31725 Добавки пищевые. Натрия фосфаты Е339. Общие технические условия

ГОСТ 31747 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 32007 Добавки пищевые. Кальция фосфаты Е341. Общие технические условия

ГОСТ 32779 Добавки пищевые. Кислота сорбиновая Е200. Технические условия

ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред

ГОСТ ISO 29981 Продукты молочные. Подсчет презумптивных бифидобактерий. Метод определения количества колоний при температуре 37°С

ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р ЕН 13060 Стерилизаторы паровые малые

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 пробиотические микроорганизмы: Жизнеспособные непатогенные, нетоксигенные микроорганизмы, поступающие в кишечник человека с пищей, благотворно воздействующие на организм человека и нормализующие состав и биологическую активность микрофлоры пищеварительного тракта (преимущественно микроорганизмы родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Lactococcus, вида Streptococcus thermophilus в монокультурах и в ассоциациях).

3.2 бифидогенные свойства: Способность специализированных и функциональных пищевых продуктов или их компонентов избирательно стимулировать рост и (или) функциональную активность защитных популяций (микроорганизмов родов Bifidobacterium, Lactobacillus) нормальной микрофлоры кишечника.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.3 тест-культуры: Стандартизованные препараты пробиотиков на основе чистых культур микроорганизмов родов Lactobacillus, Bifidobacterium и Escherichia coli, выделенных из микробиоты здорового человека, без добавления пребиотических и других стимулирующих компонентов.

3.4 определение бифидогенных свойств: Экспериментальная оценка изменений показателей жизнедеятельности микробиологического(их) тест-объекта(ов) in vitro или состава и свойств нормальной микрофлоры кишечника in vivo

3.5 представители защитной микрофлоры: Микроорганизмы кишечной микрофлоры (родов Lactobacillus, Bifidobacterium и Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью), обеспечивающие колонизационную резистентность.

3.6 колонизационная резистентность: Совокупность механизмов, поддерживающих стабильность популяционного и количественного состава компонентов нормального микробиоценоза.

3.7 пребиотические вещества: Неперевариваемые пищевые вещества, избирательно стимулирующие рост и (или) биологическую активность одного или ограниченного числа представителей защитной микрофлоры кишечника человека, способствующие поддержанию ее нормального состава и биологической активности.

4 Средства измерений, оборудование и реактивы *

________________

* Измененная редакция, Изм. N 1.

4.1 Оборудование и средства измерений

Стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ Р ЕН 13060, ГОСТ 31598.

Оборудование для сухой стерилизации (шкаф сушильный стерилизационный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 50°С до 200°С с погрешностью ±2°С.

Термостат электрический суховоздушный с диапазоном рабочих температур от 20°С до 60°С и отклонением от заданной температуры не более ±1°С.

Термошейкер-инкубатор для колб с регулируемой скоростью 1-99 об/мин и углом наклона 1-10°.

Весы лабораторные общего назначения, 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 1000 г по ГОСТ Р 53228.

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с ГОСТ 6709.

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 с мощностью бактерицидных ламп 30 Вт и производительностью (95% обеззараживания) не менее 300 м/час.

Анализатор потенциометрический для контроля рН по ГОСТ 19881 с диапазоном измерения рН 3-8, с точностью ±0,01 единицы рН при температуре 25°С по ГОСТ 27987.

Инкубаторы-анаэростаты или другие устройства, создающие анаэробные условия культивирования.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.

Электроплитка

Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности бактериальных взвесей N 10 по [1]*.

________________

* Поз.[1]-[3] см. раздел Библиография. - .

Бокс биологической защиты класса II.

Встряхиватель вибрационный типа "Вортекс" со скоростью вращения до 3000 об/мин.

Морозильная камера, обеспечивающая температуру не выше минус 20°С.

Микроскоп биологический с иммерсионной системой по ГОСТ 28489.

Дозаторы автоматические с переменным объемом дозирования от 100 до 1000 мкл.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2 Лабораторная посуда и материалы

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 29227.

Пробирки типов П1, П2 по ГОСТ 25336.

Спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 23932.

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0°С до 100°С с ценой деления шкалы 1°С по ГОСТ 13646.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Наконечники пластиковые объемом 100-1000 мм.

Ножницы медицинские по ГОСТ 21239.

Анаэробные контейнеры с оборудованием для генерирования анаэробной атмосферы, включая систему для проверки анаэробных условий.

Петля бактериологическая платино-иридиевая или никель-хромовая диаметром 3 мм.

Петля бактериологическая полимерная объемом 1, 10 мм.

Пинцет медицинский по ГОСТ 21241.

Скальпель хирургический, 15 см по ГОСТ 21240.

Термоконтейнер (сумка-холодильник).

Марля медицинская по ГОСТ 9412.

Пакеты полимерные для стерилизации лабораторных принадлежностей и обеззараживания отходов.

Перчатки полимерные по ГОСТ 3.

Колбы плоскодонные конические разной вместимости по ГОСТ 1770.

Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 см по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Флакон-диспенсер для дозирования жидкостей.

Флаконы с резьбой и крышкой стерилизуемые объемом 500-1000 см.

Фильтры мембранные с размером пор 0,2 мкм.

Пипетки градуированные по ГОСТ 29227.

Палочки стеклянные по ГОСТ 21400.

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284.

Стекла часовые.

Шпатели бактериологические.

Чашки биологические стеклянные Петри по ГОСТ 23932.

Штативы для пробирок.

4.3 Реактивы и питательные среды

Йод по ГОСТ 4159.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (дигидрофосфат) 2-водный по ГОСТ 245.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (гидрофосфат) по ГОСТ 31725.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Ацетон по ГОСТ 2768.

Водорода пероксид по ГОСТ 10929.

Хлороформ по ГОСТ 20015.

Набор реагентов для окраски по Граму.

Кристаллический фиолетовый.

D-лактоза 1-водная.

D-глюкоза по ГОСТ 6038.

Пептон мясной ферментативный по ГОСТ 13805.

Твин-80.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Кислота молочная по ГОСТ 490.

Кислота лимонная моногидрат по ГОСТ 3652, х.ч. или ч.

Кислота тиогликолевая.

Натрия тиогликолят.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280.

Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

Кислота сорбиновая по ГОСТ 32779.

Неомицин (сульфат или основание), содержание основного вещества не менее 98%.

Диклоксациллина (натриевая соль), содержание основного вещества не менее 98%.

L-цистеин гидрохлорид.

Среда тиогликолевая.

TOS-MUP агар (TOS пропионатный агар с мупироцином лития).

Среда МРС (MRS) жидкая.

Среда МРС (MRS) агаризованная.

Среда Блаурокка модифицированная.

Среда гидролизатно-молочная.

Среда кукурузно-лактозная.

Среда М-17.

Кровь баранья дефибринированная баранья или лошадиная, для питательных сред, стерильная.

Среда Эндо.

Агар Симмонса цитратный.

Среда Кесслер с лактозой.

Агар трипказо-соевый с 5% бараньей крови.

Среда молочно-ингибиторная (МИС).

Среда Сабуро агаризованнная.

Среда Чапека.

Агар Байрд-Паркера.

Солевой агар (основа желточно-солевого агара).

Среда железосульфитная.

Агар трехсахарный.

Среды Гисса.

Фенилаланин-агар.

Препарат полиферментный панкреатин (порошок, содержит липазы 10000 Ед. Евр. Фарм., амилазы 7200 Ед Евр.Фарм., общая протеолитическая активность - не менее 400 Ед. Евр.Фарм.).

Пепсин К 10% по [2].

Яйца куриные пищевые по ГОСТ 31654.

Индикаторы для контроля паровой и суховоздушной стерилизации.

Экстракт дрожжевой сухой.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Системы (мультимикротесты) для биохимической идентификации энтеробактерий*.

________________

* Примерами мультимикротестов для биохимической идентификации энтеробактерий могут быть API 10S, API 20Е, API Rapid 20E, Enterotube. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других мультимикротестов с аналогичными свойствами.

Системы (мультимикротесты) для биохимической идентификации бифидобактерий API 20А* или с аналогичными характеристиками.

________________

* Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других мультимикротестов с аналогичными свойствами.

Системы (мультимикротесты) для биохимической идентификации лактобактерий API 50CHL* или с аналогичными характеристиками.

________________

* Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других мультимикротестов с аналогичными свойствами.

Казеин по ГОСТ 31689.

Крахмал маисовый.

Масло подсолнечное по ГОСТ 1129.

Лярд.

Целлюлоза микрокристаллическая.

Витамин Е (токоферол) по ГОСТ 27547.

Витамин А (ретинол А ацетат), содержание основного вещества не менее 98%.

Витамин D (эргокальциферол), содержание основного вещества не менее 98%.

Витамин В (тиамина гидрохлорид), содержание основного вещества не менее 98%.

Рыбный жир по ГОСТ 9393.

Витамин В (рибофлавин), содержание основного вещества не менее 98%.

Витамин В (пиридоксина гидрохлорид), содержание основного вещества не менее 98%.

Витамин B (цианкобаламин), содержание основного вещества не менее 98%.

Витамин РР (никотинамид), содержание основного вещества не менее 98%.

Кальция пантотенат, содержание основного вещества не менее 98%.

Кислота фолиевая, содержание основного вещества не менее 98%.

Биотин, содержание основного вещества не менее 98%.

Менадиона натрия бисульфит, содержание основного вещества не менее 98%.

Кальция ортофосфат по ГОСТ 32007.

Калий лимоннокислый трехзамещенный 1-водный по ГОСТ 5538.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145.

Оксид магния по ГОСТ 4526.

Марганец углекислый по ГОСТ 7205.

Железо (III) лимоннокислое, 1-водное, ч., содержание основного вещества не менее 98%.

Цинк углекислый основной, ч., содержание основного вещества не менее 98%.

Медь (II) углекислая основная по ГОСТ 8927.

Натрий селенистокислый, ч., содержание основного вещества (NaSeО), не менее 98,5%.

Квасцы хромокалиевые по ГОСТ 4162.

Сахароза по ГОСТ 5833.

Инулин (полифруктозан, фруктоолигосахарид) растительный пищевой, содержание основного вещества не менее 90%.

Рис шлифованный белый по ГОСТ 6292.

Питательные среды и препараты должны соответствовать нормативным документам или документам производителя. Приготовление и контроль качества питательных сред осуществляют в соответствии с ГОСТ ISO 11133.

Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных в настоящем стандарте. Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4 Тест-культуры

Тест-культуры Lactobacillus, Bifidobacterium и E.coli сопровождаются "Паспортом штамма", выданным в соответствии с действующими нормативными документами, видовая или родовая принадлежность контрольных тест-культур должна быть подтверждена с использованием биохимических методов идентификации с помощью мультимикротестов (см. 4.3) и световой микроскопии.

Контрольные пробиотические продукты должны быть охарактеризованы по количеству жизнеспособных клеток (КОЕ) соответствующих культур, идентифицированных по родовой и видовой принадлежности.

4.5 Лабораторные животные

Для анализа в модели in vivo используют лабораторных животных - крыс - самцов линии Вистар, прошедших карантин в соответствии с [3], [4]. Состав рациона для лабораторных животных, их содержание и схема проведения анализа приведены в приложении Б.

4.6 Приготовление материалов, реактивов, питательных сред

4.6.1 Подготовка посуды и материалов

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160±5)°С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±1)°С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу.

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно в автоклаве, упакованными в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 сут при ненарушенной упаковке или в невскрытых пеналах.

4.6.2 Приготовление буферных растворов

4.6.2.1 Фосфатный буферный раствор

Для приготовления концентрированного фосфатного буферного раствора (34±0,4) г однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРО) растворяют в объеме от 500,0 до 700,0 см дистиллированной воды в мерной колбе, вместимостью 1000 см по ГОСТ 1770. Устанавливают активную кислотность раствора (7,2±0,1) ед. рН добавлением раствора гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1000,0 см. Хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника не более 30 сут.

Для приготовления разбавленного раствора 1,25 см концентрированного фосфатного буферного раствора вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 1000 см по ГОСТ 1770 и доводят объем дистиллированной водой до метки, проверяют активную кислотность, которая должна составлять (7,1±0,1) ед. рН.

Фосфатный буферный раствор разливают по 9,0 см в пробирки, по 100,0 см в колбы, вместимостью 200 см по ГОСТ 25336, и по 900,0 см в колбы, вместимостью 2000 см по ГОСТ 25336, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121±1)°С в течение (20±1) мин.

4.6.2.2 Фосфатно-тиогликолевый буферный раствор

Состав (г (см)/дм):

калия дигидрофосфат (KНРО) - 4,5 г;

натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 6,0 г;

агар-агар - 1,0 г;

тиогликолевая кислота - 0,4 см.

1,0 г агар-агара, 6,0 г натрия гидрофосфата и 4,5 г калия дигидрофосфата растворяют при нагревании в 100 см дистиллированной воды. Остужают, пипеткой добавляют 0,4 см тиогликолевой кислоты, устанавливают активную кислотность раствора (6,8±0,1) ед. рН и доводят объем смеси до 1000 см. Разливают фосфатно-тиогликолевый буферный раствор по 9,0 см в пробирки, по 100,0 см в колбы, вместимостью 200 см, и по 900,0 см в колбы, вместимостью 2000 см, закрывают ватными пробками. Стерилизуют автоклавированием при (112±1)°С в течение 5 мин.

Перед употреблением фосфатно-тиогликолевый буферный раствор разогревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин для снижения в нем содержания растворенного кислорода. В момент использования температура раствора должна составлять (38±1)°С.

4.6.2.3 Раствор лимоннокислого натрия

В 1000,0 см дистиллированной воды растворяют 20 г трехзамещенного лимоннокислого натрия, разливают в пробирки по 9,0 см или колбы; стерилизуют автоклавированием при (121±1)°С в течение (20±1) мин.

4.6.2.4 Цитратно-фосфатный буферный раствор

Цитратно-фосфатный буферный раствор (ЦФБР) с рН в диапазоне от 2,2 до 7,0 получают смешиванием двух исходных растворов: натрия гидрофосфата 2-водного (NaHPО·2HО) с молярной концентрацией 0,2 моль/дм (35,63 г/дм) и моногидрата лимонной кислоты (СНОН(СООН)·НО) с молярной концентрацией 0,1 моль/дм (21,01 г/дм). Объемы исходных растворов варьируют в зависимости от заданного значения рН ЦФБР. Соотношения исходных растворов приведены в приложении В.

Приготовленные растворы ЦФБР стерилизуют автоклавированием при температуре (121±1)°С в течение 15 мин.

4.6.3 Приготовление питательных сред для культивирования пробиотических микроорганизмов

4.6.3.1 Питательные среды для культивирования бактерий рода Lactobacillus

а) Среда МРС (MRS) жидкая - по ГОСТ 10444.11.

б) Среда МРС (MRS) агаризованная - по ГОСТ 10444.11.

Для повышения селективности питательной среды, после стерилизации к 1 дм агаризованной или жидкой среды добавляют 1 см щелочного раствора сорбиновой кислоты.

в) Щелочной раствор сорбиновой кислоты

1 г сорбиновой кислоты переносят, смывая раствором гидроокиси натрия (NaOH) с молярной концентрацией 1 моль/дм, в мерную посуду вместимостью 100 см, объем доводят до метки тем же раствором. Полученный раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670 при использовании мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм.

Допускается готовить раствор сорбиновой кислоты без фильтрации с соблюдением правил асептики, при этом используют раствор гидроокиси натрия, приготовленный в асептических условиях растворением NaOH в стерильной дистиллированной воде.

4.6.3.2 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Bifidobacterium

а) Печеночно-цистеиновая среда Блаурокка

0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от пленок и желчных протоков, измельчают, заливают 1000 см дистиллированной воды и кипятят в течение 1,5-2 ч. Отвар фильтруют, доводят до 1000 см дистиллированной водой. К полученному печеночному бульону добавляют 5,0 г натрия хлорида и 10,0 г пептона мясного ферментативного, устанавливают активную кислотность (8,15±0,50) ед. рН с помощью 10%-ного раствора NaOH и кипятят 10 мин. Полученную основу среды стерилизуют при (121±1)°С в течение 15 мин. На следующий день основу среды декантируют, доводят дистиллированной водой до 1000 см, добавляют 5,0 г глюкозы, 0,8 г агар-агара, 0,3 г цистеина. Смесь кипятят 10 мин, устанавливают рН на уровне (7,7±0,1) ед. рН, затем среду разливают в пробирки по 10 см и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 15 мин.

Среду Блаурокка проверяют на стерильность путем выдержки при температуре (37±1)°С в течение двух суток. Хранят готовую среду не более 1 мес при температуре (20±2)°С и не более 2 мес при температуре (4±2)°С. Ростовые качества каждой серии среды Блаурокка контролируют высевом контрольной тест-культуры Bifidobacterium spp.

б) Тиогликолевая среда

В 1000 см дистиллированной воды вносят 15,0 г гидролизата казеина ферментативного сухого, 5,0 г дрожжевого экстракта, 2,5 г хлорида натрия, 0,75 г агара микробиологического, размешивают и нагревают до температуры 60°С-70°С. L-цистин предварительно растворяют при постепенном добавлении 10%-ного раствора NaOH до полного растворения. Раствор цистина вносят в приготовленную смесь, устанавливают рН 8,0-8,2 с помощью 10%-ного раствора NaOH, кипятят в течение 2-3 мин до полного расплавления агара. Добавляют 5,0 г глюкозы и 0,3 см тиогликолевой кислоты (или 0,5 г натрия тиогликолята), фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают рН 7,2-7,3 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты.

Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре (121±1)°С в течение 15 мин. Готовую среду хранят в защищенном от света месте при температуре 18°С-25°С.

в) Гидролизатно-молочная среда

Гидролизованное молоко готовят по ГОСТ 10444.11.

Для приготовления 1000 см среды 150 см гидролизованного молока, разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, добавляют 2,5 г агара и нагревают до полного растворения агара. В 700 см дистиллированной воды вносят 20 г пептона ферментативного, 3,5 г хлорида натрия, 10 г лактозы и 0,5 г аскорбиновой кислоты; смесь нагревают до температуры (80±2)°С, после чего соединяют с расплавленным агаром. В смеси устанавливают рН (7,4±0,1) ед. рН, кипятят в течение (15±1) мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя.

Среду разливают в пробирки по 10,0 см и стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 30 мин.

г) Кукурузно-лактозная среда

Для приготовления 1000 см среды в 100 см дистиллированной воды вносят 2,5 г агара и нагревают до полного растворения агара. К 800 см дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 10 г лактозы, 40,0 см водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного в соотношении 1:6, 6 г лимоннокислого трехзамещенного натрия, 0,12 г сернокислого магния, 2 г фосфорнокислого двузамещенного калия, 0,5 г аскорбиновой кислоты, раствор нагревают до температуры (80±2)°С, после чего соединяют с расплавленным агаром. Полученную смесь доводят до объема 1000 см горячей дистиллированной водой и устанавливают рН среды (7,0±0,1) ед. рН с помощью 10%-ного раствора NaOH. Среду разливают в пробирки по 10,0 см и стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 30 мин. Готовую среду хранят не более 1 мес при температуре (4±2)°С.

4.6.3.3 Приготовление селективных сред для культивирования бактерий рода Bifidobacterium

а) TOS-MUP агар (TOS пропионатный агар с мупироцином лития) готовят по ГОСТ ISO 29981.

б) Среды с неомицином

Среды готовят в два этапа:

1) приготовление раствора неомицина

50 г неомицина (сульфата или основания) растворяют в 500,0 см дистиллированной воды. Массовая концентрация неомицина в растворе 100 г/дм.

2) В составе гидролизатно-молочной или кукурузно-лактозной среды массовую долю агара увеличивают до 17 г в 1000 см питательной среды. Среды разливают в широкие пробирки по (20,0±0,5) см и стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 30 мин.

При проведении анализа в готовые среды перед расплавлением вносят раствор неомицина из расчета 0,2 см раствора на 20 см среды.

в) Питательная среда МРС (MRS) с диклоксациллином

Среду готовят в три этапа:

1) Приготовление раствора селективного агента

Состав:

- диклоксациллин - 25 мг;

- дистиллированная вода - 50 см.

Диклоксациллин растворяют в дистиллированной воде, затем полученный раствор стерилизуют фильтрацией, срок хранения раствора - 15 сут при температуре 4°С.

Примечание - Допускается готовить раствор диклоксациллина без фильтрации: диклоксациллин в асептических условиях растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Непосредственно перед использованием готовят рабочее разведение этого раствора 1:10.

2) Приготовление антиоксидантного раствора

Состав:

- L-цистеина гидрохлорид - 3 г;

- дистиллированная вода - 100 см.

L-цистеина гидрохлорид растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют фильтрацией. Раствор разливают по 10 см в стерильные пробирки. Хранят раствор 15 сут при температуре 4°С.

Примечание - Допускается готовить раствор хлористого цистеина без фильтрации: в асептических условиях растворяют хлористый цистеин в стерильной дистиллированной воде.

3) Приготовление питательной среды МРС (MRS)

Готовую среду МРС (MRS) расплавляют и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 20 мин для регенерации. Затем среду охлаждают до 40°С-45°С и вносят растворы селективного агента в количестве 1 см на 100 см среды и антиоксиданта - 1 см на 100 см среды. Смесь аккуратно перемешивают, не допуская насыщения среды воздухом.

4.6.4 Приготовление питательной среды (кровяного агара) для культивирования бактерий рода Streptococcus*

________________

* При добавлении 6%-10% крови среда может использоваться для определения общего числа аэробных и анаэробных микроорганизмов.

К растопленному и охлажденному до 45°С-50°С питательному агару с 1% глюкозы добавляют 3-5% по объему дефибринированной крови животных. Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по ГОСТ 23932 по 20 см среды и подсушивают при температуре 37°С.

Допускается для культивирования бактерий рода Streptococcus применение трипказо-соевого агара с 5% бараньей крови промышленного изготовления.

4.6.5 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Bacteroides

4.6.5.1 Неомицин-агар для бактероидов

К 1 дмдистиллированной воды добавляют до 10 г пептона, 3,0 г хлористого натрия, 2,0 г гидрофосфата натрия, 3,0 г сухого мясо-пептонного бульона, 4,0 г дрожжевого экстракта, 6,0 г декстрозы, 1,0 см твин-80, 20,0 г агара, устанавливают рН среды (7,2±0,1) ед. рН, стерилизуют при 112°С в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к основному агару добавляют: 250 мг цистина, 80 мг неомицина, 200 мг дезоксихолата натрия, 30 смдефибринированной бараньей или лошадиной крови.

4.6.5.2 Желчно-эскулиновый агар для бактероидов (ВВЕ) для селективного выделения, идентификации и культивирования микроорганизмов группы Bacteroides fragilis

Основу среды готовят в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке, остужают до 45°С-50°С, асептично добавляют регидратированное содержимое флакона с селективной добавкой (содержимое флакона - 50 мг гентамицина, достаточно для приготовления 500 см готовой среды).

4.6.6 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий семейства Enterobacteriaceae, в том числе Е. coli и рода Proteus

4.6.6.1 Среда Эндо

Среду Эндо промышленного производства готовят согласно рекомендациям изготовителя. Разлитую в стерильные чашки Петри готовую среду допускается хранить при температуре (4±2)°С в течение 10 сут.

4.6.6.2 Среда Симмонса

1,5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 1 г фосфорно-кислого двузамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 3 г лимоннокислого трехзамещенного натрия растворяют в 950,0 см дистиллированной воды, добавляют 10,0 см 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают активную кислотность (6,8±0,1) ед. рН растворами NaOH или HCI, проверяя значение рН на потенциометре. Добавляют 2 г агар-агара, доводят объем дистиллированной водой до 1000 см, прогревают на водяной бане до расплавления агара, стерилизуют в течение (15±1) мин при (121±1)°С. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.

4.6.6.3 Среда Кесслер с лактозой

Используют сухую питательную среду Кесслер промышленного производства в соответствии с инструкцией по приготовлению, или готовят в соответствии с ГОСТ 31747.

4.6.7 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Enterococcus

Молочно-ингибиторную среду (МИС) готовят по ГОСТ 28566.

Среду МИС промышленного производства готовят согласно рекомендациям изготовителя.

4.6.8 Приготовление питательных сред для выделения патогенных микроорганизмов (бактерий родов Shigella, Salmonella)

Среды Плоскирева и висмут-сульфитный агар (ВСА) промышленного производства готовят согласно рекомендациям изготовителей, указанным на этикетках. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить в холодильнике в течение 10 сут.

4.6.9 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Staphylococcus

4.6.9.1 Агар Байрд-Паркер

Основа среды: 30 г сухого питательного агара на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей размешивают в 1,0 дм дистиллированной воды, добавляют 10 г пирувата натрия, 5 г хлористого лития, тщательно перемешивают. Смесь нагревают при помешивании и кипятят в течение 1 мин до полного растворения ингредиентов. Устанавливают активную кислотность (7,1±0,1) ед. рН. Разливают во флаконы объемами 100, 200 и 300 см и стерилизуют при (121±1)°С в течение (15±1) мин. Основа среды может храниться в течение месяца в условиях холодильника. Перед употреблением в растопленную и охлажденную 45°С-50°С основу, с соблюдением правил асептики прибавляют (из расчета на 100,0 см среды) 0,5 см 2%-ного раствора теллурита калия и 5,0 смяично-желточной эмульсии, приготовленной по ГОСТ 10444.1. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, в объеме, не менее 20,0 см на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24-48 ч. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате по ГОСТ ISO 11133.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.6.9.2 Желточно-солевой агар (ЖСА)

Основа среды (солевой агар): для приготовления 1000 см солевого агара к мясо-пептонному бульону с активной кислотностью (7,3±0,1) ед. рН добавляют 20 г агара и 65 г хлористого натрия, нагревают на водяной бане до расплавления агара, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 100,0 см в колбы вместимостью 250 см, и стерилизуют при (121±1)°С в течение (15±1) мин.

Перед употреблением на 100,0 см растопленного и охлажденного до (45±1)°С солевого агара добавляют 20,0 см эмульсии яичного желтка, приготовленной по ГОСТ 10444.1. После размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20,0-25,0 см и хранят в холодильнике не более 7 сут.

4.6.10 Приготовление железосульфитной среды для культивирования сульфитредуцирующих клостридий

К 1000 см дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 0,5 г сульфита натрия, 0,5 г железа (III) цитрата, 1,5 г агар-агара. Компоненты растворяют при нагревании, после этого смесь охлаждают до (50±5)°С. Устанавливают рН среды таким образом, чтобы он составлял (7,1±0,1) ед. рН. Среду разливают в пробирки по 10-12 см и стерилизуют при (121±1)°С в течение 15 мин.

Допускается применение железосульфитной среды (железосульфитного агара) промышленного производства, которую готовят согласно инструкциям изготовителя.

4.6.11 Приготовление сред для культивирования дрожжеподобных грибов и плесеней

4.6.11.1 Приготовление среды Сабуро для культивирования дрожжеподобных грибов и плесеней

К 1,0 дм дистиллированной воды добавляют 18 г агара, 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона, нагревают до полного растворения. Устанавливают уровень рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25°С он составлял (6,5±0,1) ед. рН. Разливают колбы и стерилизуют при (121±1)°С в течение 15 мин. Готовую среду хранят в холодильнике не более 14 сут.

4.6.11.2 Приготовление рисового агара для определения хламидоспор дрожжеподобных грибов

20 г белого риса заливают 1,0 дм дистиллированной воды, доводят до кипения, затем выдерживают на малом огне 45 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем водой до 1 дм, вносят 18-20 г агара, растворяя его кипячением. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при (121±1)°С в течение 15 мин. Готовую среду хранят в холодильнике не более 14 сут, перед посевом среду расплавляют в кипящей водяной бане, переливают в чашки Петри. Чашки со средой подсушивают в термостате по ГОСТ ISO 11133.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.6.12 Приготовление растворов и реактивов

4.6.12.1 Стерильная дистиллированная вода

Дистиллированную воду разливают в колбы или пробирки в необходимых количествах и стерилизуют в течение 20 мин при (121±1)°С.

4.6.12.2 Раствор натрия гидрокарбоната для нейтрализации проб 10 г гидрокарбоната натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют дистиллированной водой, доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и стерилизуют при (121±1)°С в течение 30 мин.

4.6.12.3 Реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ ISO 7218.

Допускается использовать готовые растворы промышленного производства в соответствии с рекомендациями изготовителя.

4.6.13 Среды сухие промышленного изготовления, указанные в 4.3, готовят согласно рекомендациям изготовителей, указанным на этикетках.

4.6.14 Требования безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования безопасности при подготовке и проведении анализа, требования безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.018, электробезопасности по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технических документах на применяемые средства измерений и вспомогательное оборудование. Микробиологические анализы проводят с соблюдением требований ГОСТ ISO 7218.

4.6.15 Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускается специалист, имеющий опыт работы в микробиологической лаборатории, освоивший методы и прошедший инструктаж по технике безопасности при работе с вредными веществами и пожарной безопасности.

5 Методы определения бифидогенных свойств

5.1 Метод определения бифидогенных свойств in vitro 1

5.1.1 Сущность метода

Метод оценки in vitro 1 бифидогенной активности специализированных и функциональных пищевых продуктов основан на выявлении чувствительности к воздействию анализируемого продукта тест-штаммов микроорганизмов представителей популяций защитной микрофлоры кишечника человека родов Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью.

Тест-культуры Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и E. coli вносят в модельные субстраты, содержащие анализируемые продукты, или без них (контрольные пробы), методом предельных (исчерпывающих) концентраций, выдерживают при оптимальных условиях инкубации и затем изучают морфологические, кинетические, функциональные и количественные параметры их роста.

Экспериментальную модель составляют из параллельных рядов пробирок с последовательными десятикратными разведениями Lactobacillus, Bifidobacterium и Е. coli в соответствующих питательных средах: среда МРС жидкая для Lactobacillus spp, тиогликолевая, гидролизатно-молочная или кукурузно-лактозная среды для Bifidobacterium spp, среда Кесслер с лактозой для Е. coli. В опытные ряды инокулированных тест-штаммами питательных сред вносят анализируемый продукт; контролем являются десятикратные разведения тест-микроорганизмов без добавления анализируемого продукта (ингредиента).

Расчет концентрации анализируемого продукта (ингредиента), вносимого в модельные среды, проводят таким образом, чтобы она обеспечивала соотношение "Суточная доза анализируемого продукта/объем желудка взрослого человека", при этом за средний объем желудка взрослого человека принимают величину 2250 см.

Пример расчета: Если суточная доза специализированного и функционального пищевого продукта составляет 50 г, его концентрация в модельной среде рассчитывается по формуле: и должна составлять 22,2 мг/см. Для получения этой расчетной концентрации в пробирку с 9 см модельной среды вносят 1 см раствора (взвеси) анализируемого продукта с концентрацией 222 мг/см.

По результатам анализа устанавливают значения предельных разведений тест-культур, в которых имеет место рост микроорганизмов, характерных для представителей соответствующих популяций кишечной микрофлоры, путем регистрации визуальных признаков типичных колоний в средах культивирования и (или) при подтверждающем пересеве на элективные среды, а также наличия клеток типичной морфологии при микроскопии мазков-препаратов.

На основании полученных результатов делается вывод о наличии бифидогенного действия анализируемого продукта (ингредиента) или об отсутствии бифидогенного действия в модели in vitro.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.1.2 Проведение анализа

Анализ проводят по схеме:

Контроль: тест-культуры микроорганизмов - Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и E. coli.

Ряды пробирок с последовательными десятикратными разведениями тест-культур:

1 ряд - тест-культура Lactobacillus spp. с 10 разведения до 10 разведения, без анализируемого продукта (контроль);

2 ряд - тест-культура Bifidobacterium spp. с 10 разведения до 10 разведения, без анализируемого продукта (контроль);

3 ряд - тест-культура Е. coli с 10 разведения до 10 разведения, без анализируемого продукта (контроль);

4 ряд - тест-культура Lactobacillus spp. с 10 разведения до 10 разведения и 1 см раствора анализируемого продукта расчетной концентрации;

5 ряд - тест-культура Bifidobacterium spp. с 10 разведения до 10 разведения и 1 см раствора анализируемого продукта расчетной концентрации;

6 ряд - тест-культура Е. coli с 10 разведения до 10 разведения и 1 см раствора анализируемого продукта расчетной концентрации.

Инкубирование посевов тест-культуры Е. coli проводят при (37±0,5)°С в течение 24 ч, тест-культур Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. - в течение 72 ч.

По окончании инкубирования посевов определяют предельные разведения, в которых обнаруживают рост тест-культур микроорганизмов, путем регистрации визуально характерных признаков роста в среде культивирования и при подтверждающем пересеве на дифференциально-диагностические среды, а также путем выявления клеток типичной морфологии при микроскопии мазков-препаратов (см. таблицу 1).

Таблица 1 - Характер роста тест-культур микроорганизмов

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.1.3 Обработка результатов

Количественный подсчет тест-культур в полужидких средах производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение. При отсутствии дифференцированного роста колоний учет результатов проводится по предельному разведению, в котором визуально выявляют признаки роста культуры и при микроскопии - клетки с морфологией, типичной для соответствующего тест-штамма. Результатом определения является среднеарифметическое значение величин, полученных при оценке трех параллельных повторностей, которое выражают в десятичных логарифмах - lgКОЕ/см среды.

Вывод о наличии или отсутствии бифидогенного действия анализируемого продукта на микробиоту делают на основании оценки следующих критериев:

1) при обнаружении одинакового количества тест-культур микроорганизмов в средах с анализируемым продуктом и в контрольных средах (без добавления продукта) делается вывод об отсутствии ингибирующего и бифидогенного действия анализируемого продукта в модели in vitro 1.

2) в случае достоверного превышения количества тест-культур микроорганизмов в средах с анализируемым продуктом в сравнении с контролем на 1,0 lgКОЕ/см и более делается вывод о стимулирующем бифидогенном действии анализируемого продукта в модели in vitro 1.

3) в случае достоверного уменьшения количества тест-культур микроорганизмов в средах с анализируемым продуктом в сравнении с контролем не менее чем на один логарифмический порядок делается вывод об отсутствии бифидогенного действия анализируемого продукта и о его ингибирующем действии в модели in vitro 1.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.2 Метод определения бифидогенных свойств in vitro 2

5.2.1 Сущность метода

Метод оценки in vitro 2 бифидогенных свойств основан на изучении воздействия специализированных и функциональных пищевых продуктов на степень выживания представителей защитной микрофлоры в экспериментальной модели in vitro в условиях, имитирующих процесс пищеварения в полости желудка и верхнего отдела тонкой кишки человека.

Примечания

1 Метод включает применение специальных модельных сред на основе цитратно-фосфатного буферного раствора (ЦФБР), сконструированных с учетом средних показателей кислотности желудочного и дуоденального соков и их ферментных компонентов. Условия культивирования инокулированных модельных сред предусматривают термостатирование при 37°С и непрерывное перемешивание.

2 Воздействие специализированного и функционального пищевого продукта на представителей защитной микрофлоры оценивают по степени выживания бактериальных популяций тест-штаммов при их инкубации в модельных средах с последовательным переносом инокулятов из сред, имитирующих параметры желудка, в среды с параметрами верхнего отдела тонкой кишки, а также по степени выраженности функциональных свойств тест-культур (антагонизм).

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.2.2 Проведение анализа

Анализ проводят в два этапа

а) 1 этап (модель "желудок").

В три стерильные колбы, содержащие по 10 см цитратно-фосфатного буферного раствора с активной кислотностью (2,5-3,0) ед. рН, приготовленного по 4.6.2.4, вносят: тест-культуру микроорганизмов рода Bifidobacterium в количестве 1x10 КОЕ/см, анализируемый специализированный и функциональный продукт в концентрации, рассчитанной по 5.1.1, пепсин в количестве 0,5 мг/см. Параллельно готовят аналогичную смесь без специализированного и функционального пищевого продукта (контроль, также в трех повторностях). Для контроля концентрации жизнеспособных клеток тест-штамма из исходной суспензии суточной культуры Bifidobacterium делают ряд десятикратных разведений и проводят посев в одну из сред, указанных в 4.6.3.2 для культивирования бактерий рода Bifidobacterium.

Инкубирование модельных сред проводят с использованием термошейкера-инкубатора с частотой колебаний 90 об/мин при температуре 37°С в течение 1,5 ч. Для определения количества живых клеток тест-культуры Bifidobacterium после инкубации в модели "желудок" делают высев из каждой колбы в одну из сред, указанных в 4.6.3.2 для культивирования бактерий рода Bifidobacterium.

б) 2 этап (модель "тонкая кишка").

В три стерильные колбы, содержащие по 10 см цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 7,5, приготовленного по 4.6.2.4, вносят: анализируемый специализированный и функциональный продукт в концентрации, рассчитанной по 5.1.1, ферментный препарат по 4.3 в количестве 25 мг/см, 1 см инокулята из колб после первого этапа инкубации со смесью, содержащей специализированный и функциональный пищевой продукт (опыт). Параллельно готовят аналогичную смесь без специализированного и функционального пищевого продукта (контроль, в трех повторностях), в которую добавляют по 1 см инокулята из контрольных колб 1 этапа. Инкубирование модельных сред проводят с использованием термошейкера-инкубатора с частотой колебаний 90 об/мин при температуре 37°С в течение 3 ч.

Допускается перед проведением 2-го этапа инкубации в модели "тонкой кишки" инокулят из колб, имитирующих "желудок", нейтрализовать раствором гидроокиси натрия до 7,0 ед. рН и хранить в течение ночи в холодильнике.

После инкубирования проб в модели "тонкой кишки" делают высев из каждой колбы в одну из сред, указанных в 4.6.3.2 для культивирования бактерий рода Bifidobacterium.

По окончании инкубации всех засеянных проб через (72±1) ч проводят учет результатов, отмечая наличие (отсутствие) признаков роста Bifidobacterium spp. в питательных средах, микроскопируют мазки-препараты из всех проинкубированных посевов, измеряют активную кислотность жидких сред. Количество живых клеток Bifidobacterium spp выражают в lgКОЕ/см.

По окончании инкубации тест-штамма в условиях "желудка" и "тонкой кишки" в опытных и контрольных вариантах смесей оценивают степень выживаемости популяции Bifidobacterium spp, которую рассчитывают по количеству жизнеспособных клеток и определяют как индекс выживаемости ИВ по формуле:

, (1)

где - число живых клеток тест-штамма до инкубации в модели "желудка" или "тонкой кишки";

- число живых клеток тест-штамма после инкубации в модели "желудка" или "тонкой кишки";

100 - коэффициент, %.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.2.3 Определение воздействия специализированного и функционального пищевого продукта на функциональное состояние бактерий рода Bifidobacterium

Воздействие специализированного и функционального пищевого продукта в модели in vitro 2 включает определение функционального состояния популяций Bifidobacterium spp. по их способности к кислотообразованию в средах культивирования, инокулированных тест-микроорганизмами до и после их выдерживания в моделях, имитирующих процесс пищеварения.

Таблица 2 - Критерии кислотообразующей способности Bifidobacterium spp.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.2.4 Обработка результатов определения бифидогенных свойств in vitro 2

Для определения наличия бифидогенных свойств специализированного и функционального пищевого продукта сопоставляют индексы выживаемости тест-штамма(ов) бактерий рода Bifidobacterium, полученные в трех независимых опытах при 2-3-кратном повторении измерений по 5.2.2. Для выявления статистической значимости различий между ИВ Bifidobacterium spp в модели, где рост тест-штамма был индуцирован присутствием анализируемого продукта, и ИВ интактного тест-штамма, используют непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных*. Различия между анализируемыми величинами считают достоверными при уровне значимости р0,05.

________________

* U-критерий Манна-Уитни - статистический критерий, используемый для оценки различий между двумя независимыми выборками по уровню какого-либо признака, измеренного количественно. Применяется для сравнения малых выборок.

Наличие у анализируемого продукта бифидогенных свойств признают при обнаружении ИВ, достоверно подтверждающего выживание на конечном этапе в модели "тонкой кишки" более, чем 60% от исходного количества тест-микроорганизмов Bifidobacterium spp, внесенных в модель "желудка", и при выявлении у них кислотообразующей способности, которая соответствует исходной или более высокой степени, но составляет значения не выше, чем 4,8 ед. рН среды культивирования.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3 Метод определения бифидогенных свойств in vivo

5.3.1 Сущность метода

Анализ бифидогенных свойств анализируемого продукта в условиях in vivo проводят на основании изучения видового состава и количественных уровней основных защитных популяций нормальной микрофлоры кишечника и их функциональной активности. Для этого производят посев содержимого толстого кишечника лабораторных животных, получавших функциональный пищевой продукт с кормом, при сравнении с интактными контрольными животными.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3.2 Проведение анализа

5.3.2.1 Анализ in vivo бифидогенных свойств анализируемого продукта проводят путем посевов содержимого толстого кишечника лабораторных животных, которым вводят в рацион функциональный пищевой продукт, при сравнении с животными, которым вводят функциональный пищевой ингредиент с пребиотическим действием (например, полифруктозанинулин), и контрольными животными, которые получают базовый полусинтетический рацион (см. приложение Б).

Проводят изучение защитных популяций микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp, лактозоферментирующих бактерий семейства Enterobacteriaceae), а также комменсальных и транзиторных (условно-патогенных) представителей микробиоты (цитратположительных Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., Bacteroides spp., сульфитредуцирующих бактерий рода Clostridium, бактерии рода Proteus, Staphylococcus aureus, дрожжей и плесневых грибов) на соответствующих дифференциально-диагностических и селективных средах. Изучение комменсальных и транзиторных популяций необходимо для оценки способности Bifidobacterium spp. регулировать баланс микроорганизмов в микрофлоре кишечника.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3.2.2 Приготовление суспензии содержимого слепой кишки (фекалий) животных

Пробу для анализа из содержимого слепой кишки крыс около 1 г (взвешивают на электронных весах на стерильной подложке) вносят в предварительно регенерированный тиогликолево-фосфатный буфер с 0,1% агара в соотношении 1:9. Полученную взвесь тщательно гомогенизируют и готовят из нее последовательные десятикратные разведения в фосфатно-тиогликолевом буфере от 10 до 10. Все пробирки с разведениями суспензии перемешивают вручную круговыми движениями руки при согнутом локтевом суставе.

Подготовленные разведения используют для посева на дифференциально-диагностические и селективные среды для количественного учета девяти групп микроорганизмов - представителей защитной микрофлоры и представителей транзиторной (сопутствующей) микрофлоры.

5.3.2.3 Проведение количественного микробиологического посева

Суспензию содержимого слепой кишки высевают непосредственно на поверхность плотных питательных сред или в жидкие среды в соответствии со схемой, приведенной в таблице 3. Из соответствующих разведений по 0,05 см суспензии распределяют с помощью шпателя или бактериологической петли по поверхности агаризованной среды в чашке Петри. Допускается посев на 1/2 часть чашки Петри. В жидкие и полужидкие питательные среды вносят по 1 см суспензии.

Таблица 3 - Схема первичного посева суспензии содержимого слепой кишки

Общее число анаэробных и аэробных микроорганизмов учитывают на кровяном агаре с 6%-10% крови, инкубируемым в анаэробных условиях (в атмосфере углекислого газа 5%-10%) и в аэробных условиях для сопоставления количества и морфологии выросших колоний. Инкубацию проводят при температуре 37°С в течение 48 ч.

Количество бактерий рода Bacteroides определяют с использованием часовых стекол. Из соответствующих разведений анализируемого материала наносят автоматической пипеткой по 0,05 см на поверхность кровяного агара с неомицином для бактероидов. После того, как капля "втягивается" в агар, на место посева накладывают предварительно подготовленные часовые стекла с агаром, на который посеяна культура облигатно аэробных бактерий Serratia marcencens. Их рост обеспечивает создание анаэробных условий, необходимых для культивирования бесспоровых анаэробных бактерий.

Подготовка часовых стекол

В часовые стекла заливают 1,0-2,0 см кровяного агара с неомицином, подсушивают в течение 20 мин в термостате при температуре 37°С.

Суточную культуру S. marcescens, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают 10 см стерильной дистиллированной воды, взбалтывают и выливают в чашку Петри. Затем стерильным ватным тампоном наносят суспензию на поверхность агара в часовых стеклах. После 4 ч инкубации при температуре 37°С обработанные таким образом часовые стекла накладывают на поверхность питательной среды, предназначенной для культивирования бактероидов. После инкубации в течение 48 ч выросшие колонии микроскопируют и подсчитывают. Колонии Bacteroides spp. - плоские голубоватого цвета с матовой поверхностью, с ровными или зазубренными краями, как правило, колонии мелкие.

5.3.2.4 Обработка результатов количественного микробиологического посева

Учет и обработку результатов проводят по истечении сроков инкубации по числу выросших колоний в посевах из двух последних разведений, с изучением культуральных, тинкториальных (окраска по Граму) и морфологических (микроскопия) свойств. Подсчет проводится на чашках с числом выросших колоний от 5 до 30, с расчетом среднего арифметического показателя.

Количество микроорганизмов определяемых групп, родов, видов К, КОЕ в 1 г фекалий, вычисляют по формуле:

К = число выросших колоний на чашке 20 n, (2)

где n - разведение суспензии фекалий;

20 - коэффициент пересчета на 1 см суспензии фекалий при посеве 0,05 см (0,05 см составляет 1/20 см).

Например, в посеве из разведения 10 выросло 10 колоний. 10 умножают на 20 и умножают на 10 (разведение) и получают 2,0х10 КОЕ/г.

Суммарное содержание аэробных и анаэробных микроорганизмов рассчитывают путем суммирования общего числа аэробных и общего числа анаэробных микроорганизмов, вычисленных по формуле (2).

Полученные результаты содержания микроорганизмов (плотность популяций) переводят в десятичные логарифмы числа колониеобразующих единиц на 1 г фекалий (содержимого слепой кишки) (lg КОЕ/г).

Относительное количество (доли) определяемых групп, родов, видов микроорганизмов (по отношению к суммарному содержанию аэробных и анаэробных микроорганизмов) вычисляют путем деления количества этих микроорганизмов, выраженного в lg КОЕ/г, на суммарное содержание аэробных и анаэробных микроорганизмов, выраженное в lg КОЕ/г.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3.2.5 Определение факторов патогенности у транзиторных популяций кишечной микрофлоры

Помимо количественных характеристик у анализируемых транзиторных популяций определяют наличие факторов патогенности, а при необходимости проводят идентификацию родовой и видовой принадлежности, для чего выросшие культуры подвергают дальнейшему анализу.

У Staphylococcus spp. определяют наличие лецитиназной и плазмокоагулирующей активности. У бактерий рода Proteus выявляют способность к роению и росту на средах, используемых для учета бактерий семейства Enterobacteriaceae.

У дрожжеподобных грибов определяют характер филаментации, наличие псевдомицелия и способность к образованию хламидоспор на рисовом агаре.

У бактерий семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp. изучают гемолитические свойства на кровяном агаре.

У штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae при необходимости проводят определение таксономической принадлежности с использованием систем (мультимикротестов) для биохимической идентификации энтеробактерий или посевом на диагностические среды для определения способности к ферментации углеводов (среды Гисса, трехсахарный агар) и аминокислот (фенилаланин-агар, среды с лизином, орнитином, аргинином).

Морфологию выделенных культур определяют микроскопированием окрашенных по Граму мазков-препаратов.

5.3.3 Определение характеристик защитных популяций микрофлоры

5.3.3.1 Определение функциональной активности бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из фекалий (содержимого слепой кишки) крыс

Функциональную активность популяции Bifidobacterium spp., выделенной из фекалий (содержимого слепой кишки) крыс, устанавливают по способности закислять среду культивирования путем измерения активной кислотности (рН) в средах культивирования I генерации (непосредственно в пробирках с тиогликолевой средой или средой Блаурокка) на 5 сутки выращивания. Величину рН измеряют потенциометрическим методом во всех пробирках с наличием признаков роста. Контролем служит пробирка с исходной питательной средой. Полученные значения по всем засеянным разведениям продукта, в которых проводилось измерения, суммируют и усредняют, после чего итоговое значение сопоставляют с критериями кислотообразующей способности (степенями кислотообразования) бактерий рода Bifidobacterium в соответствии с таблицей 2 (см. 5.2.3).

5.3.3.2 Определение дополнительных характеристик выделенных представителей защитной микрофлоры

Для оценки влияния специализированных и функциональных пищевых продуктов на представителей основных популяций защитной микрофлоры кишечника выделенные культуры подвергают расширенной идентификации и определению антагонистической активности по тестам, указанным в таблице 4.

Таблица 4 - Дополнительные тесты для характеристики представителей основных популяций защитной микрофлоры кишечника

Критерии оценки антагонистической активности бактерий рода Lactobacillus приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Степень антагонистической активности бактерий рода Lactobacillus

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6 Обработка результатов анализа бифидогенных свойств in vivo

6.1 Для оценки воздействия функционального пищевого продукта на состояние кишечной микрофлоры используются следующие критерии:

а) активация роста/снижение содержания представителей защитной резидентной микрофлоры на 1,0 lg КОЕ/г и более;

б) отсутствие ингибирующего эффекта - содержание микроорганизмов, относящихся к резидентной микрофлоре, находится в пределах одного порядка;

в) изменение относительных количеств (долей) представителей защитной резидентной и транзиторной микрофлоры при сопоставлении с общим числом аэробных и анаэробных микроорганизмов;

г) ингибирование роста потенциально-патогенных представителей кишечного микробиоценоза, обладающих факторами патогенности.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.2 Интерпретацию результатов проводят при условии соответствия показателей микробиоценоза у контрольных животных средним значениям популяционных уровней для здоровых взрослых животных данного вида (см. приложение А). Для тех видов микроорганизмов, сведения о популяционных значениях которых в таблице не приведены, значения у опытных животных сопоставляются с контрольными.

6.3 На основании результатов проведенных определений делают вывод о том, что анализируемый специализированный и функциональный пищевой продукт проявляет бифидогенные свойства, если:

а) не обнаружено достоверных различий между группой, получавшей анализируемый продукт и группой, получавшей функциональный пищевой ингредиент с пребиотическим действием (инулин), но обнаружены достоверные различия между группой, получавшей анализируемый продукт, и контрольной группой;

б) результаты анализа свидетельствуют о сохранении популяционных соотношений анаэробного и аэробного компонента микрофлоры; стимуляции роста представителей защитной микрофлоры, особенно бактерий рода Bifidobacterium, и ингибирования представителей кишечного микробиоценоза, обладающих факторами патогенности; отсутствии роста патогенных микроорганизмов; сохранения исходного уровня или повышении антагонистической активности популяций Bifidobacterium spp. и/или Lactobacillus spp., Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

7 Обработка результатов

Индивидуальные результаты определения содержания анализируемых представителей микрофлоры, выраженные в десятичных логарифмах числа колониеобразующих единиц на 1 г фекалий, а также относительного количества (долей) анализируемых представителей микрофлоры подвергают статистической обработке с помощью критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между опытными и контрольной группами признаются достоверными на уровне значимости Р<0,05.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

8 Оформление результатов

Результаты проведения анализа кишечной микрофлоры оформляют в виде таблицы (см. приложение А). Данные для контрольных животных вносят в колонку N 3, для опытных животных - в колонки N 4 и N 5, показатели различий между группами, рассчитанные согласно [7], в колонки N 6 и N 7.

Приложение А
(рекомендуемое)

Пример оформления результатов анализа специализированного и функционального пищевого продукта in vivo* **

______________

* Слова "in vivo" в наименовании приложения А в бумажном оригинале выделены курсивом. - .

** Измененная редакция, Изм. N 1.

Пример оформления результатов анализа функционального пищевого продукта in vivo приведен в таблице А.1.

Таблица А.1 - Пример оформления результатов анализа функционального пищевого продукта in vivo

Таблица А.1. (Измененная редакция, Изм. N 1)

Приложение Б
(обязательное)

Лабораторные животные, их содержание и рацион, схема проведения анализа in vivo*

______________

* Слова "in vivo" в наименовании приложения Б в бумажном оригинале выделены курсивом. - .

Б.1 Лабораторные животные

Анализ проводят на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 150-160 г. После десяти дней адаптации на рационе вивария у животных контролируют массу тела и определяют динамику ее прироста. Особей, отстающих в приросте массы тела, удаляют.

Б.2 Рацион лабораторных животных

Пищевая и биологическая ценность рациона должна полностью удовлетворять физиологические потребности лабораторных животных, корма должны быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты анализа. Состав базового полусинтетического рациона приведен в таблице Б.1.

Таблица Б.1 - Состав полусинтетического рациона

Состав смеси жирорастворимых витаминов приведен в таблице Б.2.

Таблица Б.2 - Состав смеси жирорастворимых витаминов

Состав смеси водорастворимых витаминов приведен в таблице Б.3.

Таблица Б.3 - Состав смеси водорастворимых витаминов

Состав солевой смеси приведен в таблице Б.4.

Таблица Б.4 - Состав солевой смеси

Б.3 Схема проведения анализа

Б.3.1 Животных делят на опытные группы, группы сравнения и контрольные группы, по 6-10 особей в каждой группе. Число групп определяется количеством анализируемых видов и/или доз потенциально бифидогенного анализируемого продукта.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Б.3.2 Опытные группы животных в ходе эксперимента подвергают воздействию анализируемого продукта (продуктов, компонентов). Группы сравнения подвергают воздействию известного пребиотического компонента (инулина). Контрольные группы животных получают базовый полусинтетический рацион.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Б.3.3 Введение анализируемого продукта или инулина в рацион лабораторных животных осуществляется путем замещения по массовой доле кукурузного крахмала, входящего в состав стандартного полусинтетического рациона.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Б.3.4 Используется принцип кормления вволю при свободном доступе к воде.

Б.3.5 Продолжительность введения анализируемого продукта составляет не менее 20 дней.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Б.3.6 Ежедневно контролируют состояние животных, поедаемость корма; еженедельно - поведение, состояние шерстного покрова, наличие/отсутствие диареи, прирост массы тела.

Б.3.7 По окончании введения анализируемого продукта животных подвергают эвтаназии одним из разрешенных для этого способов по [7].

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Б.3.8 В процессе патолого-анатомического вскрытия животных из брюшной полости выделяют слепую кишку, обвязывают лигатурой, отсекают и помещают в стерильную одноразовую посуду. Образцы хранят не более 2 ч при (4±2)°С. Для анализа микрофлоры асептически отбирают содержимое слепой кишки, из которого готовят пробу для анализа.

Приложение В
(справочное)

Приготовление цитратно-фосфатных буферных растворов

В.1 В таблице В.1 приведены объемы (см) исходных растворов натрия гидрофосфата 2-водного с молярной концентрацией 0,2 моль/дм (0,2М NaHРО·2НО) и лимонной кислоты моногидрата с молярной концентрацией 0,1 моль/дм (0,1 М СНОН(СООН)·НО), смешиванием которых получают буферный раствор с требуемым значением рН.

Таблица В.1 - Состав цитратно-фосфатных буферных растворов

В случае отклонения значения рН буферного раствора от заданной величины (не более чем на 0,1 ед. рН) его доводят до нужной величины одним из исходных растворов.

Библиография

(Измененная редакция, Изм. N 1).

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена