ГОСТ 32634-2020 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание кожи in vitro. Методы с использованием реконструированного человеческого эпидермиса

ГОСТ 32634-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека

РАЗЪЕДАНИЕ КОЖИ IN VITRO

Методы с использованием реконструированного человеческого эпидермиса

Methods for studying the effects of chemicals on the human body. In vitro skin damage. Reconstructed human epidermis methods

МКС 71.040.10; 13.020.01

Дата введения 2021-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 января 2020 г. N 126-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 мая 2021 г. N 376-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32634-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD 431:2016* "Руководство по тестированию химических веществ. Разъедание кожи in vitro: метод испытания реконструированного человеческого эпидермиса (RHE)" ("Guideline for the testing of chemicals. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method", MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .

Международный документ разработан Организацией экономического сотрудничества и развития OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА

6 ВЗАМЕН ГОСТ 32634-2014

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Разъедание кожи согласно определению, приведенному в Согласованной на Глобальном уровне системе классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций (СГС ООН) [1], представляет собой необратимое повреждение кожи, которое проявляется видимым некрозом эпидермиса и дермы, после нанесения на кожу исследуемой химической продукции. Обновленная редакция Руководства по проведению испытаний N 431 (OECD 431), на основе которого подготовлен настоящий стандарт, устанавливает метод in vitro, позволяющий идентифицировать вещества и смеси, вызывающие или не вызывающие разъедание кожи, как это предусмотрено требованиями СГС ООН [1]. Данное Руководство обеспечивает возможность классификации продукции, обладающей разъедающим действием, на соответствующие подклассы опасности.

Оценка способности химической продукции вызывать разъедание кожи обычно предполагает использование лабораторных животных (Руководство OECD по проведению испытаний N 404 (OECD 404); впервые принято в 1981 г., пересмотрено в 1992, 2002 и 2015 гг.) [2]. В дополнение к методу OECD 431 валидированы и приняты также два других метода испытаний in vitro для определения разъедающего действия химической продукции, приведенных в OECD 430 [3] и OECD 435 [4] соответственно. Кроме того, OECD 439 [5] включает метод испытаний in vitro для определения способности химической продукции вызывать раздражение кожи. Специальный документ по интегрированным подходам к испытаниям и оценке (Integrated Approaches to Testing and Assessment - IATA), распространяющийся на оценку раздражающего и разъедающего действия на кожу, включает в себя несколько модулей, в пределах которых сгруппированы применяемые источники информации и методы исследований, и содержит необходимые указания, касающиеся: (i) обобщения и использования имеющихся данных, полученных в ходе испытаний или иным путем для оценки способности химической продукции вызывать раздражение и разъедание кожи, а также (ii) выбора оптимального подхода при возникновении потребности в дополнительных испытаниях [6].

Документ OECD 431 был впервые принят в 2004 г., а затем дважды подвергался изменениям: в 2013 г., когда в него были включены дополнительные методы испытаний на реконструированном человеческом эпидермисе (RhE) с возможностью применения таких методов для классификации разъедающей химической продукции с разделением на подклассы опасности, и в 2015 г., когда он был приведен в соответствие с положениями руководящего документа IATA и дополнен описанием альтернативного метода измерений жизнеспособности клетки.

В OECD 431 приведены четыре валидированных метода испытаний, каждый из которых основан на использовании серийно выпускаемых образцов RhE. Исследования на этапе предварительной валидации [7], а также последующие валидационные исследования [8]-[10] были проведены в отношении следующих двух методов, представленных на рынке [11], [12]: EpiSkin Standard Model (SM) и EpiDerm Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (валидированные референтные методы (ВРМ)). По итогам исследований были подготовлены рекомендации, в соответствии с которыми применение упомянутых выше ВРМ в сфере государственного регулирования допускается для различения разъедающих (Р) и неразъедающих (НР) веществ, а EpiSkin также может использоваться для определения принадлежности разъедающих веществ к установленным для них подклассам опасности [13]-[15]. Как было определено в ходе валидации на основе принятых стандартов эффективности, два других доступных на рынке метода испытаний на разъедание кожи in vitro с использованием модели RhE обеспечивают получение результатов, которые аналогичны получаемым при помощи BPM EpiDerm [16]-[18]. Данные методы, SkinEthic RHE) и epiCS (ранее известный как EST-1000), также могут применяться в сфере государственного регулирования для различения разъедающих и неразъедающих веществ [19], [20]. Исследования, проведенные после валидации изготовителями моделей RhE в период с 2012 по 2014 гг. с использованием доработанного протокола для учета мешающих воздействий, возникающих при неспецифическом восстановлении MTT исследуемой химической продукцией, позволили не только повысить результативность различения P/HP-веществ, но и оптимизировать процесс определения их принадлежности к установленным подклассам опасности [21], [22]. Последующий статистический анализ данных, полученных для EpiDerm SCT, SkinEthic RHE и EpiCS после валидации, был направлен на выявление альтернативных моделей прогнозирования, повышающих вероятность построения достоверных прогнозов в части разделения продукции на подклассы опасности [23].

________________

Сокращение RhE (Reconstructed human Epidermis - реконструированный человеческий эпидермис) применяется для обозначения всех моделей, реализуемых на основе технологий RhE. Сокращение RHE в обозначении модели SkinEthic имеет аналогичную расшифровку, однако как часть торгового наименования для соответствующего метода испытаний оно записывается целиком заглавными буквами.

До начала применения в сфере государственного регулирования какого-либо предлагаемого подобного или модифицированного метода испытаний на разъедание кожи in vitro на модели RhE, отличного от ВРМ, необходимо убедиться, что его надежность, релевантность (точность), а также ограничения, которые касаются условий его предполагаемого применения, сопоставимы с аналогичными показателями ВРМ, исходя из требований стандартов эффективности (СЭ) [24], разработанных с учетом принципов Руководящего документа N 34 [25]. Присоединение к системе взаимного признания данных гарантируется только при условии, что предлагаемый новый или усовершенствованный метод испытаний, отвечающий требованиям СЭ, успешно прошел рассмотрение и его описание было включено в OECD 431. Методы, включенные в OECD 431, могут использоваться для приведения в соответствие требований к результатам испытаний на разъедание кожи in vitro, одновременно обеспечивая признание на взаимной основе результатов, полученных с использованием этих методов.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на проведение испытаний, позволяющих выявить химическую продукцию, обладающую разъедающим действием на кожу. При испытаниях предусматривается использование так называемого реконструированного человеческого эпидермиса (Reconstructed human Epidermis (RhE)) (получаемого из нетрансформированных эпидермальных кератиноцитов человека), достоверно имитирующего гистологические, морфологические, биохимические и физиологические характеристики верхних слоев человеческой кожи, т.е. собственно эпидермиса.

2 Термины, определения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие термины и сокращения с соответствующими определениями:

2.1 вещество (substance): Химические элементы и их соединения, представленные в естественном состоянии или полученные при выполнении производственного процесса, включая любые добавки, необходимые для сохранения стабильности продукта, а также любые примеси, наличие которых обусловлено применяемым процессом, но исключая любые растворители, удаление которых не сказывается на стабильности вещества или на его составе.

2.2 ВЭЖХ (HPLC - High Performance Liquid Chromatography): Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.3 : Показатель, значение которого может быть оценено путем определения времени воздействия, необходимого для снижения жизнеспособности клеток на 50%, после использования стандартного химического вещества с заданным значением концентрации (см. также ).

2.4 жизнеспособность клеток (сell viability): Параметр, определяющий суммарную активность клеточной популяции, например способность клеточных митохондриальных дегидрогеназ восстанавливать витальный краситель МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, тиазолил синий), который, в зависимости от измеряемого конечного показателя и протокола испытания, коррелирует с общим числом и/или выживаемостью клеток.

2.5 IATA (Integrated Approach on Testing and Assessment): Интегрированный подход к испытаниям и оценке.

2.6 : Показатель, значение которого может быть оценено путем определения концентрации стандартного вещества, при которой снижается жизнеспособность тканей на 50% () по истечении заданного периода воздействия, см. также .

2.7 избыточная доза (infinite dose): Количество исследуемой химической продукции, наносимой на эпидермис, превышающее количество, которое необходимо для полного и равномерного покрытия поверхности эпидермиса.

2.8 исследуемая химическая продукция (test chemical): Продукция, которая подвергается испытаниям.

2.9 UVCB (unknown, of variable composition, or of biological origin): Вещества неизвестного или переменного состава, продукты комплексных реакций или вещества биологического происхождения.

2.10 контрольная проба (control): Контрольная проба для оценки неспецифического окрашивания в нежизнеспособных тканях.

2.11 контрольная проба (control): Контрольная проба для оценки неспецифического окрашивания в жизнеспособных тканях.

2.12 многокомпонентное вещество (multi-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором две или более основные структурные составляющие содержатся в количестве 10% (по массе), но <80% (по массе). Образование многокомпонентного вещества происходит в процессе производства. Различие между смесью и многокомпонентным веществом состоит в том, что смесь образуется путем соединения двух или более веществ при отсутствии химической реакции. Многокомпонентное вещество, напротив, образуется в результате химической реакции.

2.13 МТТ (МТТ): 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид; тиазолил синий тетразолия бромид.

2.14 надежность (reliability): Показатель того, что метод испытаний может быть реализован с получением воспроизводимых результатов в рамках одной или различных лабораторий в разное время при применении одного и того же протокола. Он оценивается путем вычисления внутри- и межлабораторной воспроизводимости [25].

2.15 НСМТТ (NSMTT): Неспецифическое восстановление МТТ.

2.16 НР (NC - non corrosive): Неразъедающая.

2.17 однокомпонентное вещество (мono-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором одна основная структурная составляющая содержится в количестве не менее чем 80% (по массе).

2.18 ОП (OD - optical density): Оптическая плотность.

2.19 ПК (PC - positive control): Положительная контрольная проба, содержащая все компоненты исследуемой системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо дающего положительный отклик. Чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени отклика, получаемого для положительного контроля, этот положительный отклик не должен быть слишком завышенным.

2.20 разъедание кожи in vivo (skin corrosion in vivo): Возникновение необратимого повреждения кожи, которое проявляется видимым некрозом эпидермиса и дермы, возникающее после нанесения исследуемой химической продукции на срок до 4 ч. Разъедающее действие классифицируется по наличию язв, кровотечений, кровавых струпьев, а через 14 сут - по изменению оттенка кожи, вызванному ее обесцвечиванием, появлению участков выпадения волос (алопеции) и шрамов. В сомнительных случаях должно проводиться гистопатологическое исследование пораженных участков.

2.21 релевантность (relevance): Описание соответствия метода испытаний результату, полученному при исследованиях, а также его обоснованности и пригодности для определенных целей применения. Данная характеристика указывает пределы, в которых метод испытаний позволяет правильно измерить или спрогнозировать исследуемый биологический эффект. Релевантность включает рассмотрение точности (соответствия) метода испытаний [25].

2.22 СГС (Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химической продукции) (ООН) (GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN))): Система, предусматривающая классификацию химической продукции (веществ и смесей) в зависимости от характерных видов и уровней физической опасности, опасности для здоровья человека или опасности для окружающей среды, с применением соответствующих средств информирования, таких как пиктограммы, сигнальные слова, краткая характеристика опасности, меры по предупреждению опасности и паспорта безопасности, чтобы обеспечить информацией о ее негативном воздействии с целью защиты людей (в том числе сотрудников, работников, перевозчиков, потребителей и представителей аварийных служб) и окружающей среды [1].

2.23 смесь (mixture): Смесь или раствор, состоящие из двух или более веществ, в которых они не вступают в реакцию друг с другом.

2.24 согласованность (concordance): Показатель эффективности метода испытаний, применимый к тем методам, которые позволяют получить однозначные результаты, и являющийся одним из аспектов релевантности. Данный термин, иногда применяемый взамен термина "точность", обозначает долю химической продукции, достоверно классифицированной как дающую при испытаниях положительный или отрицательный результат. Согласованность в значительной степени зависит от преобладания среди исследуемой химической продукции таких видов продукции, которая при испытании дает положительный результат.

2.25 специфичность (specificity): Доля всей дающей отрицательный результат/неактивной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для метода испытаний, позволяющего получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности такого метода [25].

2.26 стандарты эффективности; СЭ (performance standards (PS)): Стандарты, основанные на применении валидированного метода испытаний и служащие для сравнительной оценки других предлагаемых методов испытаний, подобных ему с механистической и функциональной точки зрения. Стандарты устанавливают: (1) важнейшие составляющие метода испытаний; (2) минимальный перечень стандартных химических веществ, отобранных из числа веществ, которые применялись для подтверждения пригодности валидированного метода испытаний, а также (3) аналогичные уровни надежности и точности по результатам использования валидированного метода испытаний, которые предлагаемый метод испытаний должен демонстрировать при его оценке с использованием этого минимального перечня стандартных химических веществ [25].

2.27 точность (accuracy): Близость результата испытаний, полученного с применением соответствующего метода испытаний, к принятому эталонному значению величины. Точность является показателем эффективности метода и одним из аспектов релевантности. Данный термин часто применяется как взаимозаменяемый термину "согласованность" (concordance) для указания доли корректных результатов, полученных с применением соответствующего метода испытаний [25].

2.28 УВЭЖХ (UPLC): Ультравысокоэффективная жидкостная хроматография.

2.29 химическая продукция (chemical): Вещество или смесь веществ.

2.30 серия испытаний (run): Испытания одной химической продукции или более параллельно с отрицательной контрольной пробой и ПК.

2.31 чувствительность (sensitivity): Доля всей дающей положительный результат/активной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для методов испытаний, позволяющих получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности таких методов [25].

3 Исходные положения

3.1 Настоящий стандарт обеспечивает идентификацию разъедающих и не разъедающих кожу веществ и смесей в соответствии с положениями СГС ООН [1]. Кроме того, настоящий стандарт может применяться для определения принадлежности разъедающих веществ и смесей к подклассу опасности 1A в соответствии с положениями СГС ООН [1] либо к комбинации подклассов 1B и 1C [21]-[23]. Ограничения применения настоящего стандарта заключаются в том, что он не позволяет четко дифференцировать химическую продукцию подклассов опасности 1B и 1C в соответствии с СГС ООН [1] по причине недостаточного количества известных, хорошо изученных разъедающих веществ in vivo, относящихся к подклассу опасности 1C. Методы испытаний EpiSkin, EpiDerm SCT, SkinEthic RHE и epiCS позволяют проводить классификацию, при которой разделяется химическая продукция подклассов опасности 1A и 1B, а также подкласса опасности 1C и НР.

3.2 В процессе валидации методов испытаний, включенных в настоящий стандарт, для идентификации разъедающей кожу продукции было исследовано большое количество химической продукции, являющейся в основном веществами; всего эмпирическая база данных для валидации насчитывала 60 химических веществ, соответствующих широкому спектру классов химических соединений [8]-[10]. Испытания с целью подтверждения необходимых чувствительности, специфичности, точности и внутрилабораторной воспроизводимости каждого метода для классификации веществ с разделением на подклассы опасности проводились непосредственно его разработчиками, а результаты проведенных испытаний оценивались специалистами ОЭСР [21]-[23]. Насколько позволяет судить объем собранных данных, методы настоящего стандарта могут применяться для исследования химической продукции, являющейся представителем широкого спектра классов и агрегатных состояний, включая жидкую, твердую и воскообразную. Жидкая продукция может иметь водную или неводную основу; твердая продукция может быть растворимой или нерастворимой в воде. По возможности твердая химическая продукция перед исследованием должна быть измельчена до тонкого порошкообразного состояния; никакой другой предварительной обработки пробы не требуется. При наличии свидетельств, подтверждающих непригодность методов испытаний, установленных в настоящем стандарте, для конкретного вида химической продукции, эти методы не должны применяться при исследованиях данной химической продукции. Кроме того, допускается методы испытаний настоящего стандарта в случае их пригодности для исследований отдельных химических веществ применять для исследований смесей таких веществ. Тем не менее с учетом того, что понятие "смесь" охватывает широкий диапазон видов и составов продукции, количество доступной информации об испытаниях различных смесей в настоящее время ограничено, в случае получения возможных свидетельств, указывающих на неприменимость положений стандарта к определенному виду таких смесей (например, в соответствии со стратегией, предложенной в [26]), настоящий стандарт не должен применяться для исследований данных смесей. Перед применением настоящего стандарта для смесей веществ с целью получения информации, применяемой в сфере государственного регулирования, следует изучить вопрос, может ли (а если может, то почему) такое его использование обеспечить достижение приемлемых с точки зрения поставленной цели результатов. Изучение вопроса не требуется, если необходимость испытаний соответствующей смеси веществ прямо установлена действующими требованиями. Оценка воздействия газов и аэрозолей не проводилась в рамках валидационных исследований [8]-[10]. Это означает, что, невзирая на теоретическую осуществимость испытаний газов и аэрозолей с применением технологий RhE, настоящим стандартом такая возможность не предусмотрена.

3.3 Исследуемая химическая продукция, которая поглощает свет в том же спектральном диапазоне, что и МТТ-формазан, а также исследуемая продукция, которая способна непосредственно восстанавливать витальный краситель MTT (MTT-формазан), может препятствовать правильному определению жизнеспособности тканей и требует дополнительного использования контрольных проб для внесения соответствующих поправок в результаты. Вид контрольных проб может варьироваться в зависимости от характера мешающих воздействий, создаваемых исследуемой химической продукцией, и от применяемой методики измерений количества МТТ-формазана (подробнее см. в 7.4.2-7.4.8).

3.4 Поскольку настоящий стандарт не содержит необходимой информации по определению раздражающего действия на кожу, на исследования такого воздействия in vitro с точки зрения его влияния на здоровье человека распространяется руководство OECD 439, которое предусматривает использование той же испытательной системы RhE, но с другим протоколом [5]. Полная информация по оценке местного влияния химических веществ на кожу при их однократном воздействии представлена в Руководящем документе по интегрированным подходам к испытаниям и оценке (IATA) N 203 [6]. В соответствии с указанным документом IATA испытания in vitro на разъедание (как установлено в настоящем стандарте) и на раздражение кожи проводятся до испытаний на живых животных. Отмечается также, что при использовании человеческой кожи следует руководствоваться требованиями национальных и международных этических норм и стандартов.

4 Сущность метода испытаний

4.1 Исследуемая химическая продукция наносится местно на трехмерную модель реконструированного человеческого эпидермиса (RhE), состоящую из нетрансформированных эпидермальных кератиноцитов человека, выращенных таким образом, чтобы получить многослойную, высокодифференцированную копию естественного человеческого эпидермиса. В ней должны выделяться отчетливо выраженные базальный, шиповатый и зернистый слои, а также слоистый роговой слой (stratum corneum) с межклеточными ламеллярными липидными слоями, представляющими основные классы липидов, аналогичные тем, которые можно встретить in vivo.

4.2 Для целей испытаний с использованием модели RhE предполагается, что разъедающая кожу химическая продукция может проникать в роговой слой путем диффузии или эрозии, оказывая цитотоксическое действие на нижележащие слои клеток. Жизнеспособность клеток определяется на основе ферментативного преобразования витального красителя МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид; тиазолиловый синий тетразолия бромид; CAS 298-93-1) в синеокрашенную соль формазана, количество которой измеряется после ее экстрагирования из тканей [27]. Разъедающая кожу химическая продукция выявляется по ее способности снижать жизнеспособность клеток ниже установленных пороговых значений (см. пункты 7.6.3, 7.6.4). Применение методов испытаний на разъедание кожи с использованием модели RhE подтвердило возможность прогнозировать с их помощью разъедающее действие на кожу, наблюдаемое при проведении экспериментов in vivo на кроликах в соответствии с OECD 404 [2].

5 Подтверждение квалификации

5.1 До того как приступить к регулярному применению какого-либо из четырех методов испытаний с использованием модели RhE, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, правильно классифицировав двенадцать специально отобранных веществ, перечисленных в таблице 1. Если применяемый метод используется для классификации на подклассы опасности, также должен быть правильно присвоен подкласс опасности. В случае если лаборатория не располагает каким-либо веществом, указанным в перечне, или когда это может быть оправдано, допускается использовать другое вещество, для которого имеются соответствующие справочные данные по испытаниям in vivo и in vitro (например, взятое из перечня стандартной химической продукции [24]), при условии, что к его выбору применяются те же самые критерии, что и в таблице 1.

Таблица 1 - Перечень рекомендованных веществ для проверки квалификации

5.2 Рекомендуется, чтобы в рамках подтверждения квалификации пользователь самостоятельно проверял барьерные свойства тканей после их получения в соответствии с указаниями изготовителя соответствующей модели RhE. Это особенно важно в том случае, если транспортирование тканей осуществляется на большие расстояния и/или занимает много времени. После успешного внедрения в практику соответствующего метода испытаний и подтверждения достаточной квалификации для его применения постоянное проведение таких проверок не требуется. Тем не менее, если метод испытаний применяется на постоянной основе, рекомендуется оценку барьерных характеристик используемых тканей проводить через равные промежутки времени.

6 Описание метода испытаний

В настоящем стандарте приведено общее описание параметров и процедур методов испытаний для оценки разъедающего действия на кожу с использованием модели RhE. Модели RhE, использование которых было признано научно обоснованным, а именно EpiSkin (SM), EpiDerm (EPI-200), SkinEthic RHE и epiCS [16], [17], [19], [28]-[33], могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Разработаны стандартные операционные процедуры (СОП) для всех методов испытаний с использованием перечисленных моделей [34]-[37]; основные параметры методов испытаний обобщены в приложении А. Этими СОП следует руководствоваться при внедрении и применении любого из методов в условиях лаборатории. Испытания с применением четырех методов испытаний на основе моделей RhE, описанных в настоящем стандарте, должны соответствовать приведенным ниже требованиям.

7 Параметры методов испытаний с использованием модели RhE

7.1 Общие положения

Для создания эпителия должны использоваться нетрансформированные кератиноциты человека. Под функциональным роговым слоем (stratum corneum) должно быть расположено несколько слоев жизнеспособных эпителиальных клеток (базальный, шиповатый (stratum spinosum) и зернистый (stratum granulosum) слои). Роговой слой должен состоять из нескольких слоев с соответствующим липидным профилем для создания функционального барьера, достаточно устойчивого для быстрого проникновения стандартных цитотоксических химических веществ, например таких, как додецилсульфат натрия (ДСН) или Тритон X-100. Должна быть подтверждена эффективность барьера, обеспечиваемого используемой моделью, оценка которой выполняется либо путем определения концентрации стандартной химической продукции, при которой снижается жизнеспособность ткани на 50% () по истечении заданного периода воздействия, либо путем определения времени, необходимого для снижения жизнеспособности ткани на 50% () после нанесения стандартной химической продукции с известной заданной концентрацией (см. 7.2.2.1). Защитные свойства модели RhE должны препятствовать прохождению исследуемой продукции в жизнеспособные ткани в обход рогового слоя, так как это снижало бы достоверность моделирования воздействия химической продукции на кожу. Модель RhE не должна быть заражена бактериями, вирусами, микоплазмами или грибами.

7.2 Функциональные свойства

7.2.1 Жизнеспособность

Количественная оценка жизнеспособности тканей проводится по результатам применения МТТ-теста [27]. Жизнеспособные клетки модели ткани RhE превращают витальный краситель МТТ в синеокрашенный MTT-формазан, который затем экстрагируется из этой ткани при помощи изопропанола (или аналогичного растворителя). Оптическая плотность растворителя-экстрагента должна быть достаточно низкой: ОП<0,1. Количество экстрагированного МТТ-формазана может определяться путем стандартных измерений ОП или посредством ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии [38]. Пользователи модели RhE должны следить за тем, чтобы каждая используемая партия RhE удовлетворяла действующим критериям, установленным для отрицательной контрольной пробы. Диапазон приемлемости (верхний и нижний пределы) значений ОП отрицательной контрольной пробы должен устанавливаться разработчиком/поставщиком модели RhE. Соответствующие диапазоны приемлемости значений ОП отрицательных контрольных проб для четырех валидированных методов испытаний с использованием моделей RhE, включенных в настоящий стандарт, приведены в таблице 2. При использовании метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии диапазоны ОП отрицательных контрольных проб, приведенные в таблице 2, следует рассматривать как критерии приемлемости для этих отрицательных контрольных проб. Следует документировать, что ткани, обработанные отрицательной контрольной пробой, являются стабильными при культивировании (обеспечивают аналогичные результаты измерений ОП).

Таблица 2 - Диапазоны приемлемости значений ОП отрицательных контрольных проб, применяемых для контроля качества партии

7.2.2 Барьерные функции

Роговой слой и его липидные составляющие должны обладать достаточной устойчивостью к быстрому проникновению определенных стандартных цитотоксических химических веществ (например, таких как ДСН или Тритон X-100) в соответствии с установленными значениями или (см. таблицу 3). Эффективность барьерных функций каждой партии используемой модели RhE должна быть подтверждена разработчиком/поставщиком модели RhE после доставки тканей конечному пользователю (см. 7.2.5).

7.2.3 Морфология

Гистологическое исследование модели RhE проводится с целью подтверждения наличия у нее многослойной структуры, подобной структуре человеческого эпидермиса и включающей в себя базальный (stratum basale), шиповатый (stratum spinosum), зернистый (stratum granulosum) и роговой (stratum corneum) слои, а кроме того, обладающей липидным составом, аналогичным липидному составу человеческого эпидермиса. Проведение гистологического исследования каждой партии используемой модели RhE, подтверждающего соответствие предъявляемым требованиям морфологии тканей, должно обеспечиваться разработчиком/поставщиком модели RhE после доставки тканей конечному пользователю (см. 7.2.5).

7.2.4 Воспроизводимость

Воспроизводимость методов испытаний должна периодически контролироваться пользователями с использованием положительных и отрицательных контрольных проб. Кроме того, каждый метод испытаний должен применяться только при условии предоставления разработчиком/поставщиком соответствующей модели RhE данных, подтверждающих долговременную воспроизводимость результатов при исследованиях разъедающих и неразъедающих химических веществ, например веществ, включенных в перечень для проведения проверки квалификации (см. таблицу 1). При использовании метода испытаний для классификации на подклассы опасности воспроизводимость результатов испытаний по отнесению исследуемых веществ к подклассам опасности также должна быть подтверждена.

7.2.5 Контроль качества (КК)

Модель RhE должна использоваться только при условии подтверждения разработчиком/поставщиком соответствия каждой партии предлагаемой к использованию модели RhE критериям приемки, в первую очередь требованиям, предъявляемым к жизнеспособности (см. 7.2.1), барьерным функциям (см. 7.2.2) и морфологии (см. 7.2.3). Эти данные должны быть предоставлены пользователям методов, чтобы они могли отражать соответствующую информацию в своих отчетах об испытаниях. Только результаты испытаний, полученные при использовании партий тканей с приемлемым контролем качества, могут допускаться для классификации по разъедающему действию. Диапазон приемлемости (верхний и нижний пределы) значений или определяется разработчиком/поставщиком модели RhE. Диапазоны приемлемости для четырех валидированных методов испытаний приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Контроль качества. Критерии приемки партий

7.3 Нанесение исследуемой химической продукции и контрольных химических веществ

7.3.1 Не менее двух параллельно испытываемых образцов кожи должно использоваться для каждой химической продукции и каждой контрольной пробы для каждого времени воздействия. Количество наносимой на ткани жидкой или твердой химической продукции должно быть таким, чтобы оно обеспечивало их равномерное распределение по поверхности эпидермиса, не будучи при этом избыточной дозой, т.е. по меньшей мере 70 мм/см либо 30 мг/см. В зависимости от применяемых методов перед нанесением твердой химической продукции может потребоваться увлажнение поверхности эпидермиса деионизированной или дистиллированной водой для улучшения контакта между кожей и исследуемой химической продукцией [34]-[37]. По возможности твердая продукция должна испытываться в виде тонко измельченного порошка. Способ нанесения должен быть подходящим для исследуемой химической продукции (см., например, документы по ссылкам [34]-[37]). По окончании заданного периода воздействия исследуемая химическая продукция должна быть тщательно смыта с поверхности эпидермиса водным буферным раствором или 0,9%-ным раствором NaCl. В зависимости от того, какой из четырех валидированных методов испытаний с использованием модели RhE был выбран, применяют два или три периода воздействия для каждой исследуемой химической продукции (для всех четырех валидированных моделей RhE: 3 мин и 1 ч соответственно; для EpiSkin предусмотрен также дополнительный период воздействия продолжительностью 4 ч). В зависимости от применяемого метода испытаний с использованием модели RhE и заданного периода воздействия значение температуры в течение периода воздействия может варьироваться от комнатной до 37°C.

7.3.2 Отрицательные и положительные (ПК) контрольные пробы должны использоваться параллельно в каждой серии испытаний для подтверждения того, что жизнеспособность (по данным, полученным при помощи отрицательных контрольных проб), барьерные функции и обеспечиваемая в итоге чувствительность (по данным, полученным при помощи ПК) тканей находятся в пределах установленного диапазона приемлемых значений, основанного на результатах предыдущих наблюдений. В зависимости от используемой модели RhE в качестве ПК рекомендуется использовать ледяную уксусную кислоту или 8н раствор KOH. Следует учитывать, что 8н раствор KOH обладает способностью непосредственно восстанавливать МТТ, что может потребовать использования дополнительных контрольных проб, как указано в 7.4.2 и 7.4.3. В качестве рекомендованных отрицательных контрольных проб могут использоваться 0,9%-ный (масса/объем) раствор NaCl или вода.

7.4 Определение жизнеспособности клеток

7.4.1 Согласно настоящему стандарту для определения жизнеспособности клеток должен применяться метод с использованием МТТ, являющийся количественным методом [27]. Образец ткани помещают в раствор МТТ соответствующей концентрации (0,3 или 1 мг/см) на 3 ч. Образовавшийся в результате реакции синий формазан экстрагируют из ткани при помощи растворителя (например, изопропанола, подкисленного изопропанола) и определяют его концентрацию путем измерения ОП раствора при длине волны 570 нм с использованием фильтра, имеющего полосу пропускания не более ±30 нм, либо путем проведения ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрического анализа (см. 7.4.7 и 7.4.8) [38].

7.4.2 Исследуемая химическая продукция может оказывать мешающее воздействие на выполнение метода с использованием МТТ за счет непосредственного восстановления МТТ в синий формазан и/или за счет цветовых помех, если исследуемая химическая продукция абсорбирует МТТ самопроизвольно или вследствие обработки в том же диапазоне ОП, что и у формазана, - (570±30) нм, как правило, это характерно для сине- и пурпурноокрашенной химической продукции. Для выявления потенциальных мешающих воздействий, вызываемых исследуемой химической продукцией, таких как неспецифическое восстановление МТТ и неспецифическое окрашивание, и внесения соответствующих поправок используются дополнительные контрольные пробы - НСМТТ и НСО соответственно (см. 7.4.3-7.4.7). Это особенно важно в тех случаях, когда исследуемую химическую продукцию не удается полностью удалить с поверхности ткани при промывании или когда она проникает в толщу эпидермиса и, таким образом, присутствует в тканях во время проведения испытаний на жизнеспособность с использованием МТТ. Подробное описание порядка внесения поправок на непосредственное восстановление МТТ и цветовые помехи, создаваемые вызывающими окрашивание реагентами, содержится в СОП для соответствующих методов испытаний [34]-[37].

7.4.3 Для выявления химической продукции, непосредственно восстанавливающей МТТ, каждая исследуемая химическая продукция должна быть добавлена в свежеприготовленную среду, содержащую МТТ [34]-[37]. Если после смешивания среда приобретает синюю/пурпурную окраску, исследуемую химическую продукцию признают способной непосредственно восстанавливать MTT и переходят к следующей функциональной проверке, которая проводится на нежизнеспособном эпидермисе, независимо от того, планируется ли оценивать количество красителя на основе результатов стандартных измерений ОП или посредством ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии. Эта дополнительная функциональная проверка предусматривает использование нежизнеспособных тканей, в которых имеют место лишь остаточные явления обменной активности, но которые при этом могут абсорбировать исследуемую химическую продукцию точно так же, как и жизнеспособные ткани. Каждую химическую продукцию, способную восстанавливать МТТ, параллельно наносят не менее чем на два образца нежизнеспособной ткани для каждого заданного периода воздействия, которые подвергают полному испытанию на разъедание кожи. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как отношение разности жизнеспособности тканей (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, подвергнутых воздействию продукции, способной восстанавливать МТТ, и показателя неспецифического восстановления МТТ (в процентах), полученного на нежизнеспособных тканях, которые подвергнуты воздействию той же продукции, к результату испытаний отрицательной контрольной пробы, проводившихся в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (%НСМТТ).

7.4.4 Для выявления потенциальных мешающих воздействий, создаваемых окрашенной исследуемой химической продукцией или исследуемой химической продукцией, которая приобретает окраску при контакте с водой или изопропанолом, и принятия решения о необходимости в этой связи дополнительных контрольных проб проводят спектральный анализ данной продукции в воде (среде, в которой происходит воздействие на кожу) и в изопропаноле (экстрагирующем растворителе). Если исследуемая химическая продукция в смеси с водой и/или изопропанолом поглощает свет в диапазоне (570±30) нм, проводят контроль окрашивания или в качестве альтернативы применяют метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии - в этом случае такие испытания не требуются (см. 7.4.7, 7.4.8). При стандартных измерениях ОП каждая создающая мешающее воздействие окрашенная исследуемая химическая продукция параллельно наносится не менее чем на два образца жизнеспособной ткани для каждого заданного периода воздействия, на которых полностью воспроизводят испытания на разъедание кожи, с тем исключением, что для их обработки используют среду, не содержащую МТТ, обеспечивая таким образом контроль неспецифического окрашивания пробы (). Контрольная проба должна испытываться одновременно для каждого заданного периода воздействия параллельно с каждой окрашенной исследуемой химической продукцией (в каждой серии испытаний), что обусловлено необходимостью учитывать вариабельность биологических характеристик, свойственную жизнеспособным тканям. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как разность жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию создающей помехи химической продукции, выдерживались в растворе МТТ, и показателя неспецифического окрашивания (в процентах), полученного на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию мешающей химической продукции, но выдерживались в среде, не содержащей МТТ, в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (%).

7.4.5 Исследуемая химическая продукция, которая идентифицирована как непосредственно восстанавливающая МТТ (см. 7.4.3) и одновременно мешающая определению жизнеспособности по причине окрашивания (см. 7.4.4), при стандартных измерениях ОП требует в дополнение к контролю НСМТТ и проб , рассмотренным выше, проведения контрольных испытаний третьего вида. Такая необходимость обычно возникает в случае с темноокрашенной исследуемой химической продукцией, затрудняющей применение метода с MTT (например, сине-, пурпурно- и черноокрашенной), поскольку свойственная ей окраска препятствует оценке способности восстанавливать MTT, как указано в 7.4.3. Данная исследуемая химическая продукция может соединяться как с жизнеспособными, так и нежизнеспособными тканями, и вследствие этого контроль НСМТТ может корректировать не только потенциальную способность исследуемой химической продукции непосредственно восстанавливать МТТ, но также и цветовые помехи, обусловленные соединением окрашенной продукции с нежизнеспособными клетками. Это может привести к двойной поправке, вносимой в результаты исследований для учета неспецифического окрашивания, поскольку испытания контрольной пробы уже корректируют мешающее воздействие окрашивания при соединении исследуемой химической продукции с жизнеспособными клетками. Для исключения вероятного двойного применения поправки должна применяться третья разновидность контрольных проб на неспецифическое окрашивание нежизнеспособных тканей (). В соответствии с этой дополнительной процедурой контроля исследуемая химическая продукция наносится не менее чем на два образца нежизнеспособной ткани для каждого заданного периода воздействия, которые подвергают полной процедуре испытаний, с тем исключением, что на этапе их обработки используется среда, не содержащая МТТ. Для каждой исследуемой химической продукции достаточно только одной контрольной пробы , вне зависимости от количества независимых испытаний/серий, однако ее испытания должны проводиться параллельно с контролем НСМТТ и по возможности на образцах ткани из одной и той же партии. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как отношение разности жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, подвергавшихся воздействию исследуемой химической продукции, %НСМТТ и %, которая суммирована с показателем неспецифического окрашивания (в процентах), полученного на нежизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию создающей помехи продукции (в процентах), но выдерживались в среде, не содержащей МТТ, к результату испытаний отрицательной контрольной пробы, проводившихся в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (%).

7.4.6 Важно иметь в виду, что мешающие воздействия, обусловленные неспецифическим восстановлением MTT и цветовыми помехами, могут приводить к завышенным показаниям спектрофотометрического оборудования при анализе вытяжки из тканей, которые выходят за пределы его линейного диапазона. С учетом этого, приступая к испытаниям исследуемой химической продукции, результаты которых предназначаются для применения в сфере государственного регулирования, каждая лаборатория должна предварительно определить линейный диапазон своего спектрофотометра с использованием МТТ-формазана (CAS N 57360-69-7), приобретаемого у коммерческих поставщиков. В частности, результаты стандартных измерений ОП, выполняемых при помощи спектрофотометра, могут использоваться для оценки исследуемой химической продукции, которая способна непосредственно восстанавливать MTT и обладает мешающей окраской, если значения ОП экстракта из тканей для такой исследуемой химической продукции без внесения поправок на непосредственное восстановление МТТ и/или цветовые помехи не выходят за пределы линейного диапазона спектрофотометра либо если нескорректированная жизнеспособность (в процентах), полученная для данной химической продукции, уже позволяет рассматривать ее как разъедающую (см. 7.6.3 и 7.6.4). Вместе с тем, если результаты %НСМТТ и/или %, полученные для исследуемой химической продукции, 50% результата для отрицательной контрольной пробы, они должны использоваться с осторожностью.

7.4.7 При исследованиях темноокрашенной химической продукции, стандартные измерения ОП которой не могут быть выполнены по причине определенных мешающих воздействий при применении метода МТТ, количество МТТ-формазана может определяться альтернативным методом ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии (см. 7.4.7) [37]. Метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии обеспечивает возможность разделения МТТ-формазана и исследуемой химической продукции до начала количественного определения [38]. Это означает, что в случае применения ВЭЖХ-УВЭЖХ-спектрофотометрии необходимость в использовании контрольных проб или отсутствует, независимо от того, какая именно химическая продукция исследуется. Тем не менее контроль НСМТТ следует использовать, если исследуемая химическая продукция предположительно способна к непосредственному восстановлению МТТ или имеет окраску, которая затрудняет оценку ее способности к непосредственному восстановлению МТТ (как описано в 7.4.3). Если для измерений количества МТТ-формазана применяется метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии, жизнеспособность тканей определяется как процентное отношение площади пика МТТ-формазана, полученного на жизнеспособных тканях после воздействия на них исследуемой химической продукции, к площади пика для МТТ-формазана, полученного для параллельно испытываемой отрицательной контрольной пробы. Для исследуемой химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, фактическую жизнеспособность определяют как разность жизнеспособности (в процентах) ткани, полученной на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию исследуемой химической продукции, и значения %НСМТТ. Следует также иметь в виду, что, если химическая продукция, которая способна непосредственно восстанавливать MTT и одновременно обладает мешающей проведению анализа окраской, задерживается в тканях после обработки и восстанавливает МТТ настолько интенсивно, что уровень ОП (при стандартных измерениях ОП) или площади пиков (при измерениях посредством УВЭЖХ/ВЭЖХ-спектрофотометрии) для экстрактов исследуемых тканей выходит за пределы линейного диапазона используемого спектрофотометра, подготовить достоверную оценку их разъедающей способности не представляется возможным, хотя вероятность наличия подобной химической продукции чрезвычайно мала.

7.4.8 Метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии может использоваться для измерений количества формазана при исследовании любой химической продукции (окрашенной, неокрашенной, восстаналивающей и не восстанавливающей МТТ) [38]. С учетом большого разнообразия спектрофотометрических методов на основе ВЭЖХ/УВЭЖХ, до начала использования выбранной системы для целей количественного определения МТТ-формазана в экстрактах тканей необходимо убедиться в ее соответствии критериям приемлемости, установленным для стандартных квалификационных параметров, основанных на положениях руководства по валидации биоаналитических методов в промышленности, которое было разработано американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) [38], [39]. Данные ключевые параметры и их критерии приемлемости приведены в приложении В. Если система метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии обеспечивает соблюдение критериев согласно приложению В, она признается пригодной для выполнения количественных измерений MTT-формазана в условиях проведения испытаний, предусмотренных настоящим стандартом.

7.5 Критерии приемлемости

Для каждого метода испытаний с использованием пригодных моделей RhE ткани, обработанные отрицательной контрольной пробой, должны показывать значения ОП, которые свидетельствуют об их соответствии таблице 2 и были бы не хуже установленных ранее предельных значений. Ткани, обработанные ПК, т.е. ледяной уксусной кислотой или 8 н раствором KOH, должны проявлять способность соответствующим образом реагировать на воздействие разъедающей химической продукции в условиях метода испытаний (см. приложение А). Вариабельность характеристик для образцов тканей при параллельном нанесении на них исследуемой химической продукции и/или контрольных химических веществ не должна выходить за пределы, установленные требованиями к каждой валидированной модели RhE (см. приложение А) (так, например, расхождение показателей жизнеспособности двух образцов ткани не должно превышать 30%). Если при испытании отрицательной контрольной пробы или ПК в рамках одной серии испытаний не обеспечивается соблюдение установленных пределов, результаты таких испытаний рассматривают как не соответствующие установленным критериям и проводят испытания повторно. Если вариабельность результатов испытаний исследуемой химической продукции выходит за пределы установленного диапазона, испытания такой продукции также должны быть проведены повторно.

7.6 Интерпретация результатов и модель построения прогнозов

7.6.1 Значения ОП, полученные для каждой исследуемой химической продукции, должны использоваться для вычисления жизнеспособности (в процентах) относительно результата, полученного для отрицательной контрольной пробы, который принимается равным 100%. В случае применения метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии жизнеспособность (в процентах) ткани вычисляется как отношение площади пика для МТТ-формазана, полученного на жизнеспособных тканях после воздействия на них исследуемой химической продукции, к площади пика для МТТ-формазана, полученного при параллельном испытании отрицательной контрольной пробы. Пороговые значения жизнеспособности (в процентах) для разделения разъедающей и неразъедающей исследуемой химической продукции (или разделения ее на подклассы опасности по разъедающему действию) для каждого метода испытаний настоящего стандарта приведены в 7.6.3, 7.6.4 и должны использоваться для интерпретации получаемых результатов.

7.6.2 Одной серии испытаний, предусматривающей параллельное испытание не менее двух образцов ткани, должно быть достаточно для оценки свойств исследуемой химической продукции, если полученные при этом результаты обеспечивают ее однозначную классификацию. В случае получения сомнительных результатов, когда результаты измерений на разных образцах не обладают согласованностью, может быть принято решение о проведении второй серии испытаний, а также третьей - в случае расхождения результатов в первой и второй сериях.

7.6.3 Система оценки вероятности проявления разъедающего действия на кожу для метода испытаний с использованием EpiSkin [9], [34], [22], соответствующая системе классификации СГС ООН [1], приведена в таблице 4.

Таблица 4 - Система оценки для EpiSkin

7.6.4 Система оценки вероятности проявления разъедающего действия на кожу для метода испытаний с использованием EpiDerm SCT [10] [23] [35], SkinEthic RHE [17] [18] [23] [36], а также epiCS [16] [23] [37], соответствующая системе классификации СГС ООН [1], приведена в таблице 5.

Таблица 5 - Система оценки для EpiDermTM SCT, SkinEthicTM RHE и epiCS

8 Данные и отчеты об испытаниях

8.1 Данные

Для каждого испытания информация для отдельных образцов ткани (например, значения ОП и вычисленные значения жизнеспособности (в процентах) после воздействия каждой исследуемой химической продукции, а также результаты ее классификации) должна быть представлена в табличной форме с включенными в нее при необходимости данными, собранными при проведении повторных экспериментов. Помимо этого указывают средние арифметические значения и диапазоны жизнеспособности, а также коэффициенты вариации для параллельно обрабатываемых образцов ткани в каждом испытании. О наблюдаемых взаимодействиях с реактивом МТТ в результате способности непосредственно восстанавливать МТТ или окраске исследуемой химической продукции должно быть указано для каждой исследуемой продукции.

8.2 Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемая химическая продукция и контрольные вещества:

- однокомпонентное вещество: химическое наименование, а именно по IUPAC или CAS, номер CAS, код SMILES или InChI, структурная формула, степень чистоты, химическое наименование примесей, в случае возможности и практической целесообразности, и т.п.;

- многокомпонентное вещество, вещества неизвестного или переменного состава (UVCB) или смесь веществ: как можно более полное химическое описание (см. выше), количественное содержание и соответствующие физико-химические характеристики составляющих компонентов;

- физические свойства, растворимость в воде, а также любые другие значимые физико-химические показатели;

- происхождение, номер серии, при наличии сведений;

- способ обработки исследуемой химической продукции/контрольного вещества перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- стабильность исследуемой химической продукции, предельные сроки использования или сроки проведения повторного анализа, если они известны;

- условия хранения.

Выбранные модель RhE и протокол выполнения исследований с соответствующим обоснованием (при наличии).

Условия испытаний:

- используемая модель RhE (включая номер партии);

- сведения о калибровке средств измерений (например, спектрофотометра), длине волны и полосе пропускания (при необходимости), используемых для количественного определения МТТ-фармазана, и линейном диапазоне средства измерений;

- описание метода, используемого для количественного определения МТТ-формазана;

- описание параметров системы ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометра, если такая система используется;

- полный объем сопроводительной информации о конкретной используемой модели RhE, включая сведения о ее функциональных характеристиках. Данная информация включает следующие (но не ограничивается) данные:

1) жизнеспособность;

2) барьерные функции;

3) морфологию;

4) воспроизводимость и достоверность;

5) сведения о контроле качества (КК) данной модели;

- справочная информация о ранее полученных данных для модели. Данная информация должна включать (но не ограничиваться) сведения о приемлемости результатов КК со ссылкой на накопленные данные о соответствующей партии ткани;

- подтверждение достаточной квалификации для применения данного метода испытаний перед началом его регулярного применения путем проведения испытаний специально отобранных для этого веществ.

Порядок испытаний:

- подробное описание применяемой методики испытаний (включая операции промывания по истечении заданного периода воздействия);

- использованные дозы исследуемой химической продукции и контрольных веществ;

- длительность(и) периода воздействия и значение(я) температуры, при котором осуществлялось это воздействие;

- результаты контроля для исследуемой химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, и/или окрашенной продукции, при необходимости;

- количество образцов ткани, параллельно используемых для испытаний каждых исследуемых химической продукции и контрольных проб (ПК, отрицательной контрольной пробы, а также НСМТТТ, и , если требуется) и для каждого заданного периода воздействия;

- описание применяемых критериев принятия решений/модели построения прогнозов в зависимости от используемой модели RhE;

- описание всех изменений, внесенных в методику испытаний (включая операции промывания).

Критерии приемлемости результатов испытания и серии:

- средние арифметические значения, полученные для положительных и отрицательных контрольных проб и диапазоны приемлемости, основанные на накопленных данных прошлых наблюдений;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые параллельно наносились положительные и отрицательные контрольные пробы;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые параллельно наносилась исследуемая химическая продукция.

Результаты:

- таблица данных для каждых исследуемых химической продукции и контрольной пробы для каждого заданного периода воздействия, каждой серии испытаний и каждого параллельно испытанного образца с указанием значений ОП или площади пика для МТТ-формазана, жизнеспособности ткани (в процентах), среднего арифметического значения жизнеспособности ткани (в процентах), расхождений результатов испытаний параллельно обрабатываемых образцов, а также стандартных отклонений и/или коэффициентов вариации, если применимо;

- в случае необходимости также результаты испытаний контрольных проб, используемых для исследования химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, и/или окрашенной продукции, включая данные по ОП или площади пика МТТ-формазана, %НСМТТ, %, %, расхождения результатов испытаний параллельно обрабатываемых образцов ткани, стандартные отклонения и/или коэффициенты вариации (если приемлемо) и окончательное скорректированное значение жизнеспособности ткани (в процентах);

- результаты, полученные для исследуемой химической продукции и контрольных веществ, с точки зрения их соответствия критериям приемлемости для испытаний;

- описание прочих явлений, наблюдавшихся в ходе испытаний;

- результаты классификации со ссылкой на применявшуюся модель построения прогнозов/критерии принятия решений.

Анализ результатов

Выводы

Приложение А
(обязательное)

Основные параметры методов испытаний на разъедание кожи с использованием модели RhE

Приложение Б
(справочное)

Эффективность методов испытаний для целей классификации

В таблице ниже приведена информация об эффективности применения четырех методов испытаний, которая была подготовлена по итогам испытаний химической продукции восьмидесяти наименований, проводившихся разработчиками данных методов. Вычисления выполнялись представителями Секретариата ОЭСР, после чего полученные данные были проанализированы и одобрены специализированной экспертной подгруппой [21], [23].

Методы с использованием моделей человеческой кожи EpiSkin, EpiDerm, SkinEthic и epiCS являются пригодными для проведения классификации химической продукции на подклассы опасности (т.е. для дифференцирования lA от 1B и 1C от НР).

Сведения об эффективности, доле завышенных и заниженных оценок, а также точности (достоверности прогнозирования) четырех методов испытаний для химической продукции восьмидесяти наименований, каждая из которых испытывалась в 2-3 сериях c применением всех перечисленных методов, могут быть представлены следующим образом:

Таблица Б.1 - Информация об эффективности применения четырех методов испытаний

Приложение В
(обязательное)

Ключевые параметры и критерии приемлемости для признания системы ВЭЖХ/УВЭЖХ?спектрофотометрии пригодной для выполнения измерений MTT-формазана, экстрагируемого из тканей RhE

Таблица В.1 - Параметры и критерии приемлемости применения метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии

Приложение ДА
(справочное)

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа

Таблица ДА.1

Библиография

Электронный текст документа
и сверен по:

, 2021