ГОСТ 32635-2020 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

ГОСТ 32635-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

Methods of testing the impact of chemical products on the human body. Micronuclear test on mammalian cells in vitro

МКС 75.080

11.020

11.120.01

Дата введения 2021-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали:

(Поправка. ИУС N 2-2021).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 октября 2020 г. N 909-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32635-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD Test N 487:2016* "Руководство по испытанию химических веществ. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro" ("Guideline for testing of chemicals. In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test", MOD) путем:

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .

- включения раздела 1, дополнительных сокращений (подраздел 2.2), которые выделены в тексте курсивом;

- изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВЗАМЕН ГОСТ 32635-2014

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 2, 2021 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

Введение

Руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) по испытаниям химических веществ периодически пересматриваются в связи с научным прогрессом, меняющимися нормативными требованиями, а также в целях защиты животных. Первоначальная версия руководства OECD Test N 487 была принята в 2010 г. В 2016 г. она была пересмотрена в контексте общего пересмотра руководств OECD по генетической токсичности и отражает накопленный опыт проведения испытаний и интерпретации данных. Настоящее руководство является частью серии руководств по генетической токсикологии. В нем представлены краткая информация об испытании генетической токсичности и обзор последних изменений.

_______________

1) См. [1].

Микроядерный (MNvit) анализ in vitro - это метод оценки генотоксичности по выявлению микроядер (MN) в цитоплазме интерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Таким образом, MNvit анализ является методом in vitro, обеспечивающим всеобъемлющую основу для исследования потенциала повреждения хромосом in vitro путем определения кластогенного и анеугенного эффектов в клетках, которые подвергались делению во время или после воздействия исследуемого химического вещества (более подробная информация приведена в 4.2 настоящего стандарта). Микроядра представляют собой нарушения, которые было переданы дочерним клеткам в отличие от хромосомных аберраций, отмеченных в клетках в метафазе, которые могут не передаваться. В любом случае изменения могут быть несовместимыми с выживанием клеток.

_______________

См. [2], [3].

Настоящее руководство позволяет использовать протоколы как с применением ингибитора полимеризации актина цитохалазина В (cytoB), так и без него. Добавление cytoB перед митозом приводит к образованию двуядерных клеток и, таким образом, позволяет идентифицировать и проводить анализ микроядер только в тех клетках, которые завершили один митоз. Настоящее руководство также позволяет использовать протоколы без блокатора цитокинеза при наличии доказательств, что анализируемая клеточная популяция подверглась митозу.

_______________

См. [4], [5].

В дополнение к использованию анализа MNvit для определения веществ, индуцирующих микроядра, использование иммунохимического мечения кинетохор или гибридизации с центромерными/теломерными зондами [флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)] позволяет получить дополнительную информацию по механизмам хромосомных нарушений и образованию микроядер. Процедуры мечения и гибридизации могут быть использованы в случаях, когда происходит повышение частоты образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных факторов.

_______________

См. [6]-[17].

Поскольку микроядра в интерфазных клетках могут оцениваться относительно объективно, лабораторному персоналу нужно только определять количество двуядерных клеток при использовании cytoB и частоту возникновения микроядерных клеток во всех случаях. По этой причине микропрепараты могут быть оценены относительно быстро, а анализ может быть автоматизирован. Это позволяет на практике анализировать тысячи, а не сотни клеток при обработке, что повышает эффективность анализа. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность для выявления агентов, индуцирующих анеуплоидию, которую трудно изучать в обычном анализе на хромосомные аберрации. Однако анализ MNvit, приведенный в настоящем руководстве, не позволяет дифференцировать вещества, вызывающие изменения в количестве хромосом и/или плоидность, от веществ, индуцирующих кластогенность, без специальных методов, таких как FISH (см. предыдущий абзац).

_______________

См. [18].

Анализ MNvit является надежным и может проводиться на разных типах клеток, а также в присутствии или при отсутствии cytoB. Имеется большое количество данных, подтверждающих достоверность анализа MNvit с использованием разных типов клеток (культур клеточных линий или первичных клеточных культур). Они включают международное исследование по валидации анализа, координируемое французским обществом генетической токсикологии [ de Toxicologie (SFTG)], и доклады Международных совещаний по исследованию генотоксичности. Имеющиеся данные были также повторно оценены в ретроспективном валидационном исследовании весомости доказательств Европейским центром по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской комиссии (ЕС) и Научно-консультативным комитетом ECVAM (ESAC), и метод испытания был признан научно обоснованным. В анализе MNvit на клетках млекопитающих можно использовать культивированные клеточные линии или первичные клеточные культуры человека и грызунов. Поскольку на чувствительность анализа влияет фоновая частота микроядер, рекомендуется использовать типы клеток со стабильной и определенной фоновой частотой образования микроядер. Используемые клетки отбирают на основании способности хорошего роста в культуре, стабильности кариотипа (включая число хромосом) и спонтанной частоты микроядер. Данные, имеющиеся в настоящее время, не позволяют давать надежные рекомендации, но предполагают, что при оценке химической опасности важно учитывать статус р53, генетическую (кариотип) стабильность, способность к восстановлению ДНК и происхождение клетки (грызуна или человека), выбранной для анализа. Таким образом, пользователям данного руководства рекомендуется учитывать влияние этих и других характеристик клеток на характеристики клеточной линии при обнаружении индукции микроядер по мере развития знаний в этой области.

_______________

См. [19]-[36].

См. [19]-[23].

См. [5], [17].

См. [37]-[39].

См. [40].

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к микроядерному анализу in vitro, применяемому для оценки генотоксичности химических веществ, путем выявления микроядер в цитоплазме интерфазных клеток, деление которых произошло во время или после воздействия исследуемого вещества.

2 Термины, определения и сокращения

2.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1.1 анеуген (aneugen): Любое вещество или процесс, воздействие которых на компоненты митотического и мейотического циклов деления клеток приводит к анеуплоидии в клетках или организмах.

2.1.2 анеуплоидия (aneuploidy): Любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).

2.1.3 апоптоз (apoptosis): Процесс запрограммированной гибели клеток, характеризующийся серией этапов, приводящих к дезинтеграции клеток в мембранно-связанные частицы, которые затем элиминируются фагоцитозом или выделением.

2.1.4 клеточная пролиферация (cell proliferation): Увеличение числа клеток в результате митотического деления клеток.

2.1.5 центромера (centromere): Участок ДНК хромосомы, где две хроматиды соединяются вместе и оба кинетохора соединяются друг с другом.

2.1.6 концентрации (concentrations): Конечные концентрации исследуемого химического вещества в культуральной среде.

2.1.7 кластоген (clastogen): Любое вещество или фактор, которые вызывают структурные хромосомные аберрации в популяции клеток или эукариотических организмов.

2.1.8 цитокинез (cytokinesis): Процесс деления клеток сразу после митоза, формирующий две дочерние клетки, каждая из которых содержит одно ядро.

2.1.9 индекс пролиферации при цитокинетическом блоке; CBPI [Cytokinesis-Block Proliferation index (CBPI)]): Доля клеток второго деления в обработанной популяции относительно необработанного контроля (см. формулы в приложении А).

2.1.10 цитостатичность (cytostasis): Ингибирование роста клеток (см. формулы в приложении А).

2.1.11 цитотоксичность (cytotoxicity): Снижение индекса пролиферации цитокинетического блока (CBPI) или индекса репликации (RI) в обработанных клетках в присутствии цитохалазина В по сравнению с отрицательным контролем (см. 5.6.3.3 и приложение А).

Примечание - Для исследований, проводимых без цитохалазина В, цитотоксичность определяют как уменьшение относительного удвоения популяции (RPD) или относительного возрастания количества клеток (RICC) в обработанных клетках по сравнению с отрицательным контролем (см. 5.6.3.4 и приложение А).

2.1.12 генотоксичность (genotoxic): Общий термин, охватывающий все типы повреждений ДНК или хромосом, включающий разрывы, аддукты, перестройки, мутации, хромосомные аберрации и анеуплоидию.

Примечание - Не все типы генотоксических эффектов приводят к мутациям или стабильным хромосомным нарушениям.

2.1.13 интерфазные клетки (interphase cells): Клетки не в стадии митоза.

2.1.14 кинетохор (kinetochore): Белоксодержащая структура, формирующаяся на центромере хромосомы, с которой во время клеточного деления связаны волокна веретена деления, обеспечивающие точное расхождение дочерних хромосом к полюсам дочерних клеток.

2.1.15 микроядра (micronuclei): Небольшие ядра, отделенные от основных ядер клеток и являющиеся дополнительными к ним, которые образуются во время телофазы митоза или мейоза при отставании фрагментов хромосом или целых хромосом.

2.1.16 митоз (mitosis): Деление клеточного ядра, обычно состоящее из нескольких стадий - профазы, прометафазы, метафазы, анафазы и телофазы.

2.1.17 митотический индекс (mitotic index): Отношение числа клеток в метафазе к общему числу клеток в наблюдаемой клеточной популяции - показатель клеточной пролиферации в данной популяции.

2.1.18 мутагенный (mutagenic): Вызывающий наследуемое изменение последовательностей пар оснований ДНК в генах или структуре хромосом (хромосомные аберрации).

2.1.19 нерасхождение (non-disjunction): Нарушение расхождения парных хроматид и правильной сегрегации при образовании дочерних клеток, приводящее к аномальному числу хромосом в дочерних клетках.

2.1.20 статус р53 (р53 status): Белок р53, участвующий в регуляции клеточного цикла, в апоптозе и репарации ДНК.

Примечание - Клетки с дефицитом функционального белка р53, не способные остановить клеточный цикл или устранить поврежденные клетки с использованием апоптоза или других механизмов (например, индукции репарации ДНК), связанных с функциями р53 в ответ на повреждение ДНК, теоретически должны быть более подвержены мутациям генов или хромосомным аберрациям.

2.1.21 полиплоидия (polyploidy): Численные нарушения хромосом в клетках или организмах, затрагивающие полный(е) набор(ы) хромосом в противоположность нарушениям по одной или нескольким хромосомам (анеуплоидия).

2.1.22 индекс пролиферации; PI [proliferation Index (PI)]: Метод измерения цитотоксичности, при котором не используют cytoB (см. формулы в приложении А).

2.1.23 относительное увеличение количества клеток; RICC [Relative Increase in Cell Count (RICC)]: Метод измерения цитотоксичности, при котором не используют cytoB (см. формулы в приложении А).

2.1.24 относительное удвоение популяции (RPD) [Relative Population Doubling (RPD)]: Метод измерения цитотоксичности, при котором не используют cytoB (см. формулы в приложении А).

2.1.25 индекс репликации; Rl [Replication Index (RI)]: Доля завершенных циклов деления клеток в обработанных культурах по отношению к необработанным контролям в течение периода воздействия и восстановления (см. формулы в приложении А).

2.1.26 фракция печени S9 (S9 liver fraction): Супернатант гомогената печени после центрифугирования 9000 g, экстракт сырой печени.

2.1.27 смесь S9 (S9 mix): Смесь фракции печени S9 и кофакторов, необходимых для метаболической активности ферментов.

2.1.28 контроль растворителя (solvent control): Общий термин для определения контрольных культур, обработанных только растворителем, используемым для растворения исследуемого химического вещества.

2.1.29 необработанный контроль (untreated control): Культуры клеток, которые не подвергают обработке (т.е. отсутствуют исследуемое химическое вещество или растворитель), но одновременно подвергают тем же процедурам, что и культуры, обрабатываемые исследуемым химическим веществом.

2.2 В настоящем стандарте использованы следующие сокращения:

CBPI - индекс пролиферации при цитокинетическом блоке;

cytoB - цитохалазин В;

DNA - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК);

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ;

MN - микроядро;

MNvit - микроядерный анализ in vitro;

PI - индекс пролиферации;

PHA - фитогемагглютинин;

Rl - индекс репликации;

RICC - относительное увеличение количества клеток;

RPD - относительное удвоение популяции.

3 Основные положения и ограничения

3.1 Проведение испытаний in vitro обычно требует использования экзогенного источника метаболической активации, за исключением случаев, когда клетки обладают метаболической компетентностью в отношении исследуемых веществ. Система экзогенной метаболической активации не может полностью имитировать условия in vivo. Следует проявлять осторожность для предотвращения условий, которые могут привести к артефактным положительным результатам, не отражающим генотоксичности исследуемых химических веществ. Такие условия включают изменение значения pH или осмотической концентрации, взаимодействие со средой для культивирования клеток или избыточные уровни цитотоксичности (см. 5.6.3.6).

_______________

См. [41]-[43].

См. [44], [45].

3.2 Для анализа индукции микроядер необходимо, чтобы митозы были как в обработанных, так и в необработанных культурах. Для подсчета микроядер наиболее информативной является стадия, при которой клетки прошли один митоз во время или после обработки исследуемым химическим веществом. Для промышленных наноматериалов необходимы специальные модификации, которые не представлены в настоящем стандарте.

3.3 Перед использованием настоящего стандарта для испытания смеси для получения данных, предназначенных для целей регулирования, следует рассмотреть вопрос о возможности обеспечения адекватных результатов. Такие соображения не нужны, когда существует нормативное требование для испытания смеси.

4 Принципы испытания

4.1 Культуры клеток человека или млекопитающих подвергаются воздействию исследуемого химического вещества как с экзогенным источником метаболической активации, так и без него, если только не используются клетки с адекватной способностью к метаболизму (см. 5.4).

4.2 Во время и после воздействия исследуемого химического вещества клетки выращивают в течение периода, достаточного для формирования хромосомных и других нарушений клеточного цикла/деления клеток, которые могут привести к образованию микроядер в интерфазных клетках. Для индукции анеуплоидии исследуемое вещество обычно должно присутствовать во время митоза. Отобранные и окрашенные интерфазные клетки анализируют на наличие микроядер. В идеале микроядра следует оценивать только в тех клетках, которые завершили митоз во время воздействия исследуемого вещества или в течение периода после воздействия, при использовании. В культурах, которые были обработаны блокатором цитокенеза, это легко достигается путем подсчета только двуядерных клеток. В отсутствие блокатора цитокинеза на основании увеличения популяции клеток важно подтвердить, что анализируемые клетки прошли клеточное деление во время или после воздействия исследуемого химического вещества. Для всех протоколов важно продемонстрировать, что пролиферация клеток прошла как в контрольных, так и в обработанных культурах, и определить степень химически индуцированной цитотоксичности или цитостатичности во всех культурах, в которых анализируют микроядра.

5 Описание метода

5.1 Клетки

5.1.1 Для испытания используют первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека или других млекопитающих и ряд клеточных линий грызунов, таких как CHO, V79, CHL/IU и L5178Y, или клеточные линии человека, такие как TK6 (см. Введение). Для анализа микроядер использовали также другие клеточные линии - НТ29, Сасо-2, HepaRG, клетки HepG2, A549 и первичные клетки эмбриона сирийского хомячка, но они к настоящему времени тщательно не валидированы. Поэтому использование этих клеточных линий и типов должно быть обосновано подтвержденными результатами исследований в соответствии с критериями приемлемости, приведенными в 7.2. Было отмечено, что cytoB может влиять на рост клеток L5178Y, и поэтому его не рекомендуется использовать для этой линии клеток. По причинам гуманного обращения с животными при использовании первичных клеток следует по возможности использовать клетки человека и отбирать образцы в соответствии с этическими принципами и нормами.

_______________

См. [7], [20], [46], [47].

См. [19]-[23], [26]-[29], [31], [33]-[36].

См. [48].

См. [49].

См. [50], [51].

См. [52], [53].

См. [54].

См. [23].

5.1.2 Лимфоциты периферической крови человека отбирают у молодых (приблизительно от 18 до 35 лет) некурящих индивидов, без известных заболеваний или недавних воздействий генотоксических агентов (например, химических веществ, ионизирующих излучений) на уровнях, которые могли бы увеличить фоновую частоту образования микроядерных клеток. Это обеспечивает низкую и стабильную фоновую частоту возникновения микроядерных клеток. Базовая частота микроядерных клеток увеличивается с возрастом, и эта тенденция более выражена у женщин, чем у мужчин. При использовании объединения клеток более чем от одного донора следует указать число доноров. Необходимо продемонстрировать, что клетки до начала обработки исследуемым химическим веществом были разделены на образцы. Культуры клеток поддерживают в экспоненциальной фазе роста (клеточные линии) или стимулируют к делению (первичные культуры лимфоцитов), чтобы воздействовать на клетки в разных стадиях клеточного цикла, поскольку чувствительность клеточных стадий к исследуемым веществам может быть неизвестна. Первичные клетки, которые для деления необходимо стимулировать митогенами, как правило, во время воздействия испытуемого химического вещества (например, клетки лимфоцитов человека после 48-часовой митогенной стимуляции) больше не синхронизируют. Не рекомендуется использовать синхронизированные клетки во время обработки исследуемым химическим веществом, но это может быть приемлемым, если оправданно.

_______________

См. [55].

5.2 Среда и условия культивирования

Для поддержания культур используют подходящую культуральную среду и условия инкубации [культуральная посуда, увлажненная окружающая среда, содержащая 5% (при необходимости), температура - 37°С]. Клеточные линии регулярно проверяют на стабильность количества модальных хромосом и отсутствие контаминации микоплазмы. Не следует использовать культуры при выявлении контаминации микоплазмы или изменении модального числа хромосом. Должна быть установлена нормальная продолжительность клеточного цикла для клеточных линий или первичных культур, используемых в испытательной лаборатории, и она должна соответствовать опубликованным характеристикам клеток.

5.3 Подготовка культур

5.3.1 Клеточные линии

Клетки отбирают из исходных (сток) культур, высевают в культуральную среду с такой плотностью, чтобы клетки в суспензиях или в монослоях продолжали расти экспоненциально до времени сбора (например, следует избегать слияния клеток, растущих в монослоях).

5.3.2 Лимфоциты

Цельную кровь, обработанную антикоагулянтом (например, гепарином), или выделенные лимфоциты культивируют (например, в течение 48 ч - для лимфоцитов человека) в присутствии митогена [например, фитогемагглютинина (PHA) - для лимфоцитов человека], чтобы вызывать деление клеток перед воздействием исследуемого химического вещества и cytoB.

5.4 Метаболическая активация

При работе с клетками с недостаточной эндогенной метаболической способностью используют систему экзогенной метаболической активации. Наиболее часто используемая система, рекомендуемая по умолчанию, если только другая система не является оправданной, включает кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9) печени грызунов (как правило, крыс), обработанных индукторами ферментов, такими как Arochlor 1254, или комбинацию фенобарбитала и -нафтофлавона. Последняя комбинация не противоречит Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязнениям, и было показано, что она так же эффективна, как Aroclor 1254, в случае индукции оксидаз со смешанной функцией. Обычно фракцию S9 используют в концентрациях от 1% об. до 2% об., но она может быть увеличена до 10% об. в конечном объеме среды. Следует избегать использования препаратов, снижающих митотический индекс, особенно образующих комплекс с кальцием. На выбор типа и концентрации используемой системы экзогенной метаболической активации или метаболического индуктора может влиять класс исследуемых веществ.

_______________

См. [56], [57].

См. [58]-[60].

См. [61].

См. [62].

5.5 Подготовка исследуемого химического вещества

Твердые химические вещества растворяют в соответствующих растворителях и разбавляют, при необходимости, перед обработкой клеток.

Жидкие исследуемые химические вещества могут быть добавлены непосредственно в испытуемую систему и/или разбавлены перед ее обработкой. Газообразные и летучие соединения следует испытывать при соответствующих модификациях стандартного протокола, таких как обработка в герметизированных сосудах. Подготовку исследуемого химического вещества проводят непосредственно перед обработкой, если отсутствуют данные о стабильности при соответствующих условиях хранения.

_______________

См. [63]-[65].

5.6 Условия испытаний

5.6.1 Растворители

Растворитель выбирают таким образом, чтобы оптимизировать растворимость исследуемых химических веществ, не оказывая неблагоприятного воздействия на проведение анализа, то есть на изменение роста клеток, целостность исследуемого химического вещества, реакцию с культуральными сосудами, нарушение системы метаболической активации. Рекомендуется, по возможности, в первую очередь использовать водные растворы (или культуральные среды). Хорошо изученными растворителями являются вода или диметилсульфоксид (ДМСО). Обычно органические растворители не должны превышать 1% об. При растворении cytoB в ДМСО общее количество используемого органического растворителя для исследуемого химического вещества и cytoB не должно превышать 1% об. В противном случае следует использовать необработанные контроли, чтобы убедиться, что процентное содержание органического растворителя не оказывает вредного воздействия. Содержание водных растворителей (физиологический раствор или вода) не должно превышать 10% об. в конечной обработанной среде. При использовании растворителей, отличных от только хорошо зарекомендовавших себя (например, этанол или ацетон), их применение следует подтвердить данными, указывающими на их совместимость с исследуемым химическим веществом, испытуемой системой и на отсутствие генетической токсичности в используемой концентрации. При отсутствии подтверждающих данных необходимо включать необработанные контроли (см. приложение А), а также контроль растворителя, чтобы подтвердить, что выбранный растворитель не вызывает вредных или хромосомных эффектов (например, анеуплоидию или кластогенность).

5.6.2 Использование cytoB как блокатора цитокинеза

5.6.2.1 Одним из важнейших аспектов при проведении MNvit является обеспечение прохождения анализируемыми клетками митоза во время обработки или в период инкубации после обработки, при использовании. Поэтому подсчет микроядер следует ограничить клетками, которые прошли митоз во время или после обработки. Для блокирования цитокинеза наиболее широко используют cytoB, который подавляет сборку актина и соответственно препятствует разделению дочерних клеток после митоза, приводя к формированию двуядерных клеток. При использовании cytoB одновременно может быть определено влияние исследуемого химического вещества на кинетику пролиферации клеток. При использовании лимфоцитов человека следует применять cytoB в качестве блокатора цитокинеза, потому что время клеточного цикла у доноров будет варьироваться и не все лимфоциты будут реагировать на стимуляцию PHA (фитогемагглютинин). Для других типов клеток использовать cytoB не обязательно, если можно установить, что они подверглись делению (см. 5.6.3.4). Кроме того, cytoB обычно не используют при оценке наличия микроядер в образцах с использованием методов проточной цитометрии.

_______________

См. [6], [66], [67].

5.6.2.2 Для обеспечения оптимальной частоты двуядерных клеток в лаборатории для каждого типа клеток должна быть установлена необходимая концентрация cytoB в культурах контроля растворителя и подтверждено, что она обеспечивает достаточный выход двуядерных клеток для подсчета. Оптимальная концентрация cytoB обычно составляет от 3 до 6 мкг/мл.

_______________

См. [19].

5.6.3 Измерение клеточной пролиферации и цитотоксичности и выбор концентраций для обработки

5.6.3.1 При определении максимальной концентрации исследуемого вещества следует избегать концентраций, которые могут вызвать искусственный положительный ответ, сильную цитотоксичность (см. 5.6.3.6), образование осадка в культуральной среде (см. 5.6.3.7) или заметные изменения значения pH или осмотической концентрации (см. 3.1). Если добавление исследуемого химического вещества вызывает заметное изменение значения pH среды, для предотвращения искусственных положительных результатов и обеспечения соответствующих условий культивирования можно регулировать значение pH путем буферизации конечной обработанной среды.

5.6.3.2 Чтобы убедиться, что во время испытания митозу подверглось достаточное количество обработанных клеток и что воздействие проводят при соответствующих уровнях цитотоксичности (см. 5.6.3.6), проводят анализ клеточной пролиферации. Цитотоксичность определяют в основном испытании с метаболической активацией и без нее, используя соответствующие индикаторы гибели и роста клеток (см. 5.6.3.3 и 5.6.3.4). Несмотря на то, что оценка цитотоксичности в предварительном испытании может быть полезна для лучшего определения концентраций, которые будут использоваться в основном испытании, предварительный анализ не является обязательным и его выполнение не заменяет измерения цитотоксичности в основном испытании.

5.6.3.3 Обработка культур cytoB и определение относительных частот одноядерных, двухъядерных и многоядерных клеток в культуре обеспечивают точность количественного определения эффекта воздействия на клеточную пролиферацию и цитотоксичность или цитостатическую активность и обеспечивают микроскопическую оценку только тех клеток, деление которых происходит во время или после обработки. Количественную оценку цитотоксической и цитостатической активностей при обработке проводят путем сравнения значений индекса пролиферации при цитокинетическом блоке (CBPI) или индекса репликации (RI) не менее чем для 500 клеток на культуру (см. формулы в приложении А) в обработанных и контрольных культурах. Оценка других показателей цитотоксичности (например, целостности клеток, апоптоза, некроза, подсчета метафаз, клеточного цикла) может дать полезную информацию, но ее не следует использовать вместо CBPI или RI.

_______________

См. [6].

См. [6], [27], [68].

5.6.3.4 В исследованиях без cytoB необходимо показать, что значительная часть оцениваемых клеток подвергалась делению во время или после обработки исследуемым химическим веществом, в противном случае могут быть получены ложноотрицательные ответы. Для оценки цитотоксической и цитостатической активности воздействия рекомендуется проводить измерение относительного удвоения популяции (RPD) или относительного возрастания числа клеток (RICC) (см. формулы в приложении А). При увеличении продолжительности времени отбора проб (например, продолжительность обработки от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов и сбор клеток после дополнительной продолжительности от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов приводят к тому, что время отбора проб превышает нормальную длину клеточного цикла в 3-4 раза, как приведено в 6.1.3 и 6.1.4) RPD может недооценить цитотоксичность. После 1,5-2 нормальных длин клеточного цикла лучшим показателем цитотоксичности будет RICC. Оценка других маркеров цитотоксичности или цитостаза [например, целостность клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз, индекс пролиферации (PI), клеточный цикл, нуклеоплазматические мостики или зародыши ядра] может дополнительно предоставить полезную информацию, но ее не следует использовать вместо RPD или RICC.

_______________

[17], [68]-[71].

См. [71].

5.6.3.5 Следует оценить не менее трех концентраций исследуемого вещества (не считая растворитель и положительный контроль), отвечающих критериям приемлемости (соответствующая цитотоксичность, количество клеток и т.д.). Для каждой концентрации исследуемого вещества, независимо от типа клеток (клеточные линии или первичные культуры лимфоцитов), можно использовать обработанные культуры как реплицированных, так и отдельных клеток. Несмотря на то, что целесообразно использовать параллельные (дублирующие) культуры, также приемлемо использовать отдельные культуры при условии подсчета одинакового общего количества клеток для всех культур. Использование отдельных культур особенно актуально при оценке более трех концентраций исследуемого вещества (см. 6.3.3, 6.3.4). Результаты, полученные от независимых повторных культур при заданной концентрации вещества, могут быть объединены для анализа данных. Для исследуемых химических веществ, демонстрирующих небольшую или нулевую цитотоксичность, обычно приемлемы 2-3-кратные интервалы концентрации. В случае проявления цитотоксичности концентрации, выбранные для испытания, должны охватывать диапазон от концентраций, вызывающих цитотоксичность (см. 5.6.3.6), до концентраций, при которых наблюдают умеренную или незначительную цитотоксичность или ее отсутствие. Для исследуемых химических веществ, имеющих крутую зависимость концентрация - эффект, для получения данных с низкой и умеренной цитотоксичностями или для подробного изучения зависимости отклика от дозы необходимо использовать более узкий интервал между концентрациями и/или более трех концентраций (отдельные или параллельные культуры), в частности в ситуациях, когда требуется повторный анализ (см. 7.3.4).

5.6.3.6 Если максимальная концентрация основана на цитотоксичности, то наивысшая концентрация предназначена для достижения цитотоксичности (55±5)% с использованием рекомендуемых параметров цитотоксичности [т.е. снижение RICC и RPD для клеточных линий без применения cytoB и снижение CBPI или RI при использовании cytoB до (45±5)% относительно параллельного отрицательного контроля]. Следует проявлять осторожность при интерпретации положительных результатов, обнаруженных только в диапазоне высокого уровня цитотоксичности (55±5)%.

_______________

См. [72].

См. [71].

5.6.3.7 Для малорастворимых исследуемых химических веществ, не обладающих цитотоксичностью при концентрациях ниже предела растворимости, воздействие максимальной анализируемой концентрации должно вызывать помутнение или образование осадка, видимого невооруженным взглядом или с использованием инвертированного микроскопа. Даже если цитотоксичность выше, чем самая низкая концентрация нерастворимого вещества, рекомендуется проводить испытание только при одной концентрации, вызывающей помутнение или видимый осадок, поскольку в результате образования осадка могут возникать артифициальные эффекты. При концентрации, приводящей к образованию осадка, следует позаботиться о том, чтобы осадок не влиял на проведение испытания (например, окрашивание или подсчет). Перед проведением анализа может быть полезным определение растворимости в культуральной среде.

5.6.3.8 Если не наблюдают образования осадка или ограничения цитотоксичности, максимальная исследуемая концентрация должна соответствовать 10 мМ, 2 мг/см или 2 мкл/см, в зависимости от того, что является минимальным. Когда исследуемое вещество не имеет определенного состава, например вещество неизвестного или переменного состава, сложные продукты реакции или биологические материалы (например, UVCB), вредные воздействия окружающей среды и т.д., при отсутствии достаточной цитотоксичности может потребоваться более высокая максимальная концентрация (например, 5 мг/см) для увеличения концентрации каждого из компонентов. Эти требования могут отличаться для лекарственных препаратов для человека.

_______________

См. [73]-[75].

См. [76].

См. [93].

5.6.4 Контроли

5.6.4.1 В каждое испытание должны быть включены параллельные отрицательные контроли (см. 5.6.1), в обрабатываемую среду которых входит только растворитель, и обработанные таким же образом, что и обрабатываемые культуры.

5.6.4.2 Для подтверждения способности лаборатории выявлять кластогены и анеугены в условиях используемого протокола испытаний и эффективности системы экзогенной метаболической активации (при применении) требуется параллельный положительный контроль. Примеры веществ положительного контроля приведены в таблице 1. При обосновании можно использовать другие вещества для положительного контроля.

Таблица 1 - Эталонные вещества, рекомендованные для лабораторных квалификационных испытаний и для выбора положительных контролей

5.6.4.3 В настоящее время неизвестны анеугены, которые требуют метаболической активации для их генотоксической активности. Поскольку анализы in vitro по определению генотоксичности на клетках млекопитающих при непродолжительных воздействиях, проводимых одновременно с метаболической активацией и без нее с использованием одного и того же периода воздействия, достаточно стандартизированы, использование положительных контролей может быть ограничено кластогеном, требующим метаболической активации. В этом случае один ответ кластогенного положительного контроля будет показывать как активность системы метаболической активации, так и ответную реакцию анализируемой системы. При длительной обработке (без S9) необходим положительный контроль, поскольку продолжительность воздействия отличается от варианта исследования с использованием метаболической активации. Если в качестве единственного положительного контроля для непродолжительного воздействия с метаболической активацией и без нее выбирают кластоген, то для долгосрочного воздействия без метаболической активации рекомендуется выбирать анеуген. Положительные контроли как для кластогенности, так и для анеугенности также следует использовать в метаболически компетентных клетках, которые не требуют S9.

5.6.4.4 Каждое вещество положительного контроля следует использовать при одной или нескольких концентрациях, которые, как ожидается, дадут воспроизводимые и обнаруживаемые увеличения по сравнению с фоном, чтобы продемонстрировать чувствительность испытуемой системы (т.е. эффект четкий, но не позволяет исследователю сразу идентифицировать зашифрованный препарат), и ответ не должен быть вызван цитотоксичностью, превышающей пределы, указанные в настоящем стандарте.

_______________

См. [17].

6 Проведение испытаний

6.1 Схема обработки

6.1.1 Для максимального повышения вероятности выявления анеугена или кластогена, действующего на определенной стадии клеточного цикла, необходимо, чтобы исследуемым химическим веществом было обработано достаточное количество клеток, представляющих разные стадии клеточного цикла. Все виды обработки культуры должны начинаться и заканчиваться в период, когда клетки растут экспоненциально и продолжают рост до момента отбора проб. Таким образом, схема обработки клеточных линий и первичных клеточных культур может несколько отличаться от схемы обработки лимфоцитов, для начала клеточного цикла которых требуется митогенная стимуляция. Для лимфоцитов наиболее эффективный период воздействия исследуемым химическим веществом составляет от 44 до 48 ч после стимуляции PHA (фитогемагглютинин), в период асинхронного деления клеток.

_______________

См. [17].

См. [6].

6.1.2 Было показано, что большинство анеугенов и кластогенов выявляются после непродолжительного периода обработки от 3 до 6 ч (в присутствии и при отсутствии S9) с последующим удалением исследуемого химического вещества и отбором проб в момент времени, эквивалентный продолжительности приблизительно от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов после начала обработки.

_______________

См. [19].

См. [7].

6.1.3 Однако для подробной оценки, необходимой для установления отрицательного результата, проводят три исследования в следующих условиях: с использованием кратковременного воздействия исследуемого вещества с метаболической активацией и без нее и длительного воздействия без метаболической активации (см. 7.2, 7.3.1 и 7.3.2):

- клетки в течение от 3 до 6 ч подвергают воздействию исследуемого химического вещества без метаболической активации и отбирают пробу после периода времени, равного приблизительно продолжительности от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов после начала обработки;

_______________

См. [19].

- клетки в течение от 3 до 6 ч подвергают воздействию исследуемого химического вещества с метаболической активацией и отбирают пробу после периода времени, равного приблизительно продолжительности от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов после начала обработки;

_______________

См. [19].

- клетки до момента отбора проб подвергают воздействию без метаболической активации в течение времени, равного приблизительно продолжительности от 1,5 до 2 нормальных клеточных циклов.

В случае если любое из вышеприведенных условий испытания приводит к положительному ответу, возможно, нет необходимости исследовать другие схемы обработки.

Если известно или есть основания предполагать, что исследуемое химическое вещество влияет на продолжительность клеточного цикла (например, при испытании аналогов нуклеозидов), особенно для компетентных клеток р53, время до начала отбора проб или восстановления может быть продлено на продолжительность следующих от 3 до 4 клеточных циклов после начала краткосрочного и долгосрочного воздействий). Эти варианты относятся к ситуациям, когда могут возникнуть опасения относительно возможности взаимодействия между исследуемым химическим веществом и cytoB. При увеличении времени до отбора проб (т.е. когда общее время культивирования составляет от 3 до 4 клеточных циклов) необходимо следить за тем, чтобы клетки продолжали активно делиться. Например, для лимфоцитов экспоненциальный рост через 96 ч после стимуляции может снижаться, и однослойные культуры клеток могут сливаться.

_______________

См. [35], [36], [77].

6.1.4 Предлагаемая схема обработки клеток приведена в таблице 2. Общие схемы обработки можно модифицировать (при обосновании) в зависимости от стабильности и реакционной способности исследуемого вещества или особых характеристик роста используемых клеточных линий.

Таблица 2 - Время обработки клеток и получения результатов в MNvit анализе

6.1.5 В монослойных культурах в конце обработки после воздействия в течение от 3 до 6 ч могут присутствовать митотические клетки (идентифицируемые как круглые и отделяющиеся от поверхности). Поскольку эти клетки легко отделяются от поверхности, они могут быть потеряны при удалении среды, содержащей исследуемое химическое вещество. При наличии доказательств значительного увеличения числа митотических клеток по сравнению с контролем, что указывает на вероятную остановку митоза, клетки следует собирать центрифугированием и возвращать в культуру, чтобы при анализе избежать потери клеток, находящихся в митозе, которые могут содержать микроядра/хромосомные аберрации.

6.2 Фиксация клеток и приготовление препаратов

6.2.1 Каждую культуру собирают и обрабатывают отдельно. Приготовление препаратов может включать гипотоническую обработку, но этот шаг не является необходимым, если соответствующее распределение клеток достигнуто другим способом. Для приготовления предметных стекол можно использовать разные методы при условии получения качественных клеточных препаратов для оценки. Для обнаружения микроядер (в методе с блокировкой цитокинеза) и надежной идентификации двуядерных клеток должны быть сохранены клетки с интактной клеточной мембраной и неповрежденной цитоплазмой.

6.2.2 Можно использовать разные методы окраски препаратов, такие как Гимза или окрашивание флуоресцентными ДНК специфическими красителями. Использование соответствующих флуоресцентных красителей (например, акридинового оранжевого или Hoechst 33258 плюс пиронин-Y) может устранить некоторые артефакты, связанные с применением не специфичных к ДНК красителей. Антикинетохорные антитела, FISH с панцентромерными ДНК зондами или мечение in situ панцентромер специфическими праймерами в сочетании с соответствующим контрастным окрашиванием ДНК можно использовать для идентификации содержания (целые хромосомы будут окрашены, тогда как фрагменты ацентрических хромосом окрашены не будут) микроядер, если информация о механизме их образования представляет интерес. Можно использовать другие методы дифференцировки между кластогенами и анеугенами, если доказана и подтверждена их эффективность. Например, для определенных линий клеток выявление sub-2N ядер в гиподиплоидных случаях с использованием таких методов, как анализ изображений, лазерная сканирующая цитометрия или проточная цитометрия, также может предоставить полезную информацию. Морфологические наблюдения ядер также могут указывать на возможную анеуплоидию.

_______________

См. [78].

См. [79].

См. [16], [17].

См. [80]-[82].

При этом метафазный анализ хромосомных аберраций (предпочтительно с тем же типом клеток и протоколом со сравнимой чувствительностью) также может быть полезным способом определения, являются ли микроядра следствием поломок хромосом (учитывая, что потеря хромосом не будет обнаружена при анализе хромосомных аберраций).

6.3 Анализ

6.3.1 Перед проведением микроскопического анализа частоты микроядер все препараты, в том числе контроля растворителя, необработанного контроля (при использовании) и положительного контроля, должны быть независимо зашифрованы. При использовании автоматизированной системы оценки, например проточной цитометрии, лазерной сканирующей цитометрии или анализа изображений, следует использовать соответствующие методы для контроля любой систематической ошибки или погрешности. Независимо от автоматизированной платформы, используемой для подсчета микроядер, CBPI, Rl, RPD или RICC оценивают одновременно.

6.3.2 В культурах обработанных cytoB для оценки частоты микроядер должно быть проанализировано не менее 2000 двуядерных клеток для каждой концентрации и контроля, равномерно распределенных между параллельными анализами (репликатами), при их использовании. При испытании отдельной культуры на дозу (см. 5.6.3.5) должно быть оценено не менее 2000 двуядерных клеток на культуру. Если для оценки при каждой концентрации доступно менее 1000 двуядерных клеток на культуру (для параллельных культур) или 2000 (для отдельной культуры) и не обнаружено значительного увеличения количества микроядер, испытание повторяют, используя большее количество клеток или менее цитотоксические концентрации, в зависимости от того, что целесообразно. Не следует учитывать двуядерные клетки неправильной формы или с двумя ядрами, сильно отличающимися по размеру. Не следует путать двуядерные клетки с ненормально разбросанными многоядерными клетками. Клетки, содержащие более двух ядер, не следует анализировать на наличие микроядер, поскольку исходная (спонтанная) частота микроядер в этих клетках может быть выше. Допускается подсчет одноядерных клеток, если доказано, что исследуемое химическое вещество влияет на активность cytoB. В таких случаях может быть полезен повторный анализ без cytoB. Оценка одноядерных клеток в дополнение к двуядерным клеткам может представить полезную информацию, но не является обязательной.

_______________

См. [83].

См. [84].

См. [85], [86].

6.3.3 В испытаниях с клеточными линиями без cytoB проводят анализ микроядер не менее чем на 2000 клеток на концентрацию исследуемого вещества и контроль, равномерно распределенных между параллельными испытаниями, если их используют. В испытаниях с постановкой одной культуры на концентрацию (см. 5.6.3.5) анализируют не менее 2000 клеток на культуру. Если для оценки при каждой концентрации доступно менее 1000 клеток на культуру (для параллельных культур) или 2000 (для отдельной культуры) и не обнаружено значительного увеличения количества микроядер, испытание повторяют, используя большее количество клеток или менее цитотоксические концентрации, в зависимости от того, что целесообразно.

_______________

См. [83].

6.3.4 При использовании cytoB для оценки клеточной пролиферации (см. приложение А) следует определять CBPI или RI, анализируя не менее 500 клеток на культуру. При воздействии в отсутствие cytoB следует получить данные, что анализируемые клетки прошли пролиферацию (см. 5.6.3.1-5.6.3.5).

6.4 Квалификация лаборатории

6.4.1 Для подтверждения достаточного опыта лаборатории перед проведением рутинных анализов она должна провести серию испытаний с эталонными веществами положительного контроля, действующими по разным механизмам (не менее одного с метаболической активацией, одного без нее и одного, действующего по анеугенному механизму, выбранных из веществ, приведенных в таблице 1, и разных отрицательных контролей (включая необработанные культуры и разные растворители/носители). Ответы этих положительных и отрицательных контролей должны соответствовать данным научной литературы. Это не предусматривается для лабораторий, имеющих опыт, т.е. имеющих историческую базу данных, как установлено в 6.5.

6.4.2 При выборе веществ положительного контроля (см. таблицу 1) следует провести испытания при кратковременном и длительном воздействиях в отсутствие метаболической активации, а также при кратковременном воздействии в присутствии метаболической активации, чтобы продемонстрировать их способность выявлять кластогенные и анеугенные вещества, определяющие эффективность системы метаболической активации и подтверждающие пригодность процедур оценки (микроскопический визуальный анализ, проточная цитометрия, лазерная сканирующая цитометрия или анализ изображений). Диапазон концентраций выбранных веществ подбирают таким образом, чтобы обеспечить воспроизводимые и обусловленные концентрацией увеличения над фоновым уровнем для того, чтобы продемонстрировать чувствительность и динамический диапазон испытуемой системы.

6.5 Исторические контрольные данные

6.5.1 Лаборатория должна установить:

- исторический диапазон положительного контроля и распределения,

- исторический диапазон отрицательного контроля (необработанный контроль, контроль растворителя) и распределения.

6.5.2 При получении первых данных для создания базы данных исторического отрицательного контроля результаты параллельных отрицательных контролей должны соответствовать опубликованным данным отрицательного контроля, если они существуют. Поскольку к контрольному распределению добавляется больше экспериментальных данных, данные параллельных отрицательных контролей в идеале должны находиться в 95%-ном доверительном интервале контрольных пределов этого распределения. Историческая база данных отрицательного контроля лаборатории изначально должна быть построена по результатам не менее чем 10 испытаний, но для составления базы данных предпочтительно наличие результатов не менее 20 экспериментов, проведенных в сопоставимых условиях. Лаборатории должны использовать методы контроля качества, такие как контрольные карты [например, контрольная карта числа несоответствий (C-charts) или гистограмма средних значений (X-bar charts)], чтобы определить вариабельность данных положительного и отрицательного контролей, и показать, что процедура испытаний в лаборатории находится "под контролем". Дополнительные рекомендации о порядке создания и использования базы данных исторического контроля (то есть критерии включения (и исключения) данных в базу данных исторического контроля и критерии приемлемости для данного испытания) приведены в научной литературе.

_______________

См. [83]

См. [87], [88].

См. [88].

См. [87].

6.5.3 Любые изменения в протоколе испытания следует рассматривать с точки зрения согласованности данных с существующими базами данных исторического контроля лаборатории. Любые серьезные несоответствия должны привести к созданию новой базы данных исторического контроля.

6.5.4 Данные отрицательного контроля должны состоять из числа микроядерных клеток одной культуры или суммы параллельных культур (см. 5.6.3.5). Данные параллельного отрицательного контроля в идеале должны находиться в 95%-ном доверительном интервале контрольных пределов базы данных исторического отрицательного контроля лаборатории. Если данные параллельного отрицательного контроля выходят за пределы 95%-ных контрольных пределов, они могут быть приемлемы для включения в базу данных исторического контрольного распределения, если эти данные не являются экстремальными выбросами и имеются доказательства того, что система испытаний находится "под контролем" (см. 6.5.2) и есть доказательства отсутствия технической ошибки или ошибки оператора.

_______________

См. [87], [88].

7 Данные и отчетность

7.1 Представление результатов

7.1.1 При использовании методики цитокинетического блока для оценки индукции микроядер используют только частоты двуядерных клеток с микроядрами (независимо от числа микроядер на клетку). Подсчет количества клеток с одним, двумя и более микроядрами может дать полезную информацию, но не является обязательным.

7.1.2 Параллельно проводят оценку цитотоксичности и/или цитостатичности для всех культур - обработанных, отрицательного и положительного контролей. Необходимо вычислить CBPI или RI для всех обработанных и контрольных культур как меру задержки клеточного цикла при использовании метода цитокинетического блока. При отсутствии cytoB следует использовать RPD или RICC (см. приложение А).

_______________

См. [16].

7.1.3 Данные приводят по отдельным культурам. Дополнительно все данные следует обобщить в табличной форме.

7.2 Критерии приемлемости

7.2.1 Приемлемость испытания основана на следующих критериях:

- результат параллельного отрицательного контроля считают приемлемым для добавления в базу данных исторического отрицательного контроля лаборатории при соответствии 6.5.2;

- параллельные положительные контроли (см. 6.5.2) должны вызывать ответы, совместимые с ответами, приведенными в исторической базе данных положительного контроля лаборатории, обеспечивающие статистически значимое увеличение по сравнению с одновременным отрицательным контролем;

- должны быть выполнены критерии пролиферации клеток при контроле растворителя (см. 5.6.3.2-5.6.3.4);

- все экспериментальные условия были проверены, кроме тех случаев, когда одно экспериментальное условие привело к положительным результатам (см. 6.1.1-6.1.5);

- анализируют адекватное количество клеток и концентраций (см. 5.6.3.5 и 6.3.2-6.3.4);

- критерии выбора максимальной концентрации соответствуют критериям, приведенным в 5.6.3.1-5.6.3.8.

7.3 Оценка и интерпретация результатов

7.3.1 При условии, что все критерии приемлемости выполнены, исследуемое химическое вещество считают явно положительным, если в любом из исследованных условий анализа (см. 6.1.1-6.1.4):

- хотя бы одна из испытуемых концентраций демонстрирует статистически значимое увеличение по сравнению с параллельным отрицательным контролем;

_______________

См. [89].

- увеличение зависит от дозы, по крайней мере, при одном исследуемом параметре при оценке с помощью соответствующего анализа тенденции (тренд-теста) (см. 5.6.3.5);

- любой из результатов находится за пределами распределения исторических данных отрицательного контроля [например, на основе 95%-ных контрольных пределов по Пуассону (см. 6.5.4)].

Когда все эти критерии соблюдены, считают, что исследуемое химическое вещество способно вызывать разрывы хромосом и/или увеличение или потерю в этой испытуемой системе. Рекомендации по выбору наиболее подходящих статистических методов приведены в научной литературе.

_______________

См. [90]-[92].

7.3.2 При условии, что все критерии приемлемости выполнены, исследуемое химическое вещество считают явно отрицательным, если во всех исследованных условиях анализа (см. 6.1.1-6.1.4):

- ни одна из испытуемых концентраций не демонстрирует статистически значимого увеличения по сравнению с одновременным отрицательным контролем;

- нет никакого связанного с концентрацией увеличения при оценке с использованием соответствующего анализа тенденции (тренд-теста);

- все результаты находятся в пределах распределения базы данных исторического отрицательного контроля (например, на основе 95%-ных контрольных пределов по Пуассону; см. 6.5.4).

В таком случае считают, что исследуемое химическое вещество не способно вызывать разрывы хромосом и/или увеличение или потерю в этой испытуемой системе. Рекомендации по выбору наиболее подходящих статистических методов приведены в научной литературе.

_______________

См. [90]-[92].

7.3.3 Отсутствуют требования для верификации явно положительного или явно отрицательного ответа.

7.3.4 Если ответ не является явно отрицательным или явно положительным, как указано выше, и/или если необходима помощь в установлении биологической значимости результата, данные должны быть оценены экспертным заключением и/или дальнейшими исследованиями. Может быть полезным подсчет дополнительных клеток (при необходимости) или проведение повторного анализа, возможно с использованием модифицированных условий испытаний [например, интервал концентрации, другие условия метаболической активации (то есть концентрация S9 или происхождение S9)].

7.3.5 В редких случаях (даже после проведения дальнейших исследований) совокупность данных не позволяет сделать положительное или отрицательное заключение, и поэтому результаты будут считаться сомнительными.

7.3.6 Исследуемые химические вещества, которые вызывают образование микроядер в микроядерном (MNvif) анализе in vitro, могут достигать этого, поскольку они вызывают разрыв хромосом, потерю хромосом или их комбинацию. Дальнейший анализ с использованием антикинетохорных антител, центромерных специфических зондов in situ или других методов может быть использован для определения того, обусловлен ли механизм индукции микроядра кластогенной и/или анеугенной активностью.

7.4 Отчет о результатах испытаний

Отчет о результатах испытаний должен содержать следующую информацию:

7.4.1 Исследуемое химическое вещество:

- источник, номер партии, срок годности (при наличии);

- стабильность исследуемого химического вещества (если известна);

- способность исследуемого химического вещества вступать в реакцию с растворителем/носителем или средой для культивирования клеток;

- растворимость и стабильность исследуемого химического вещества в растворителе (если известна);

- измерение значения pH, осмотической концентрации и осадка в культуральной среде при добавлении исследуемого химического вещества (при необходимости).

7.4.1.1 Однокомпонентное вещество:

- физические свойства, растворимость в воде и дополнительные соответствующие физико-химические свойства;

- химическая идентификация, такая как наименование по IUPAC или CAS, номер CAS, код SMILES или InChl, структурная формула, чистота, химическая идентификация примесей и соответствующие дополнительные физико-химические свойства.

7.4.1.2 Многокомпонентное вещество, UVBC и смеси:

- характеризуют (насколько это возможно) химическим наименованием (см. выше), количественным содержанием и соответствующими физико-химическими свойствами компонентов.

7.4.2 Растворитель:

- обоснование выбора растворителя;

- процентное содержание растворителя в конечной культуральной среде.

7.4.3 Клетки:

- тип и источник используемых клеток;

- пригодность используемого типа клеток;

- отсутствие микоплазмы в случае клеточных линий;

- для клеточных линий - информация о продолжительности клеточного цикла или об индексе пролиферации;

- при работе с лимфоцитами пол доноров крови, возраст и любая соответствующая информация о доноре, цельная кровь или отдельные лимфоциты, используемый митоген;

- нормальное (отрицательный контроль) время клеточного цикла;

- число пассажей (если использовали) - для клеточных линий;

- методы поддержания клеточных культур - для клеточных линий;

- модальное количество хромосом - для клеточных линий.

7.4.4 Условия испытаний:

- идентификация вещества, блокирующего цитокинез (например, cytoB), при использовании, а также его концентрация и продолжительность воздействия на клетки;

- концентрация исследуемого химического вещества, выраженная в виде конечной концентрации в культуральной среде (например, мкг или мг/см или ммоль культуральной среды);

- обоснование выбора концентраций и количества культур, включая данные о цитотоксичности и ограниченной растворимости исследуемого вещества;

- состав среды, концентрация (если использовали), уровень влажности;

- концентрация (и/или объем) растворителя и исследуемого химического вещества, добавленного в культуральную среду;

- температура и время инкубации;

- продолжительность обработки культуры исследуемым химическим веществом;

- время после обработки до фиксации;

- плотность клеток при посеве (если применимо);

- тип и состав системы метаболической активации [источник S9, способ приготовления смеси S9, концентрация или объем смеси S9 и S9 в конечной культуральной среде, контроль качества S9 (например, ферментативная активность, стерильность, метаболическая способность)];

- вещества положительного и отрицательного контролей, конечные концентрации, условия и продолжительность периодов воздействия и восстановления;

- методы приготовления препаратов и использованные методы окрашивания;

- критерии подсчета микроядерных клеток (отбор анализируемых клеток и идентификация микроядер);

- количество проанализированных клеток;

- методы измерения цитотоксичности;

- любая дополнительная информация, относящаяся к цитотоксичности и используемому методу;

- критерии для признания исследований положительными, отрицательными или сомнительными;

- использованный(е) метод(ы) статистического анализа;

- методы, например использование кинетохорных антител или панцентромерных специфических зондов для определения того, содержат ли микроядра цельные или фрагментированные хромосомы (при использовании);

- методы, используемые для определения значения pH, осмоляльности и осадка.

7.4.5 Результаты:

- определение приемлемых клеток для анализа;

- количество клеток, подвергнутых воздействию в отсутствие cytoB, и количество клеток после обработки до фиксации для каждой культуры в случае клеточных линий;

- использованный способ измерения цитотоксичности, например: CBPI или RI в случае блокировки цитокинеза; RICC или RPD (если методы блокировки цитокинеза не используют), другие наблюдения, при необходимости (например, слияние клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз, частота двуядерных клеток);

- признаки образования осадка и время его определения;

- данные о значении pH и осмотической концентрации обрабатываемой среды (если они определены);

- распределение одно-, дву- и многоядерных клеток при использовании метода блокировки цитокинеза;

- количество клеток с микроядрами, приведенное отдельно для каждой обработанной и контрольной культуры и определенное вне зависимости от того, являются ли клетки двуядерными или одноядерными (при необходимости);

- зависимость концентрация - ответ (при возможности);

- данные параллельных отрицательных (растворитель) и положительных контролей (концентрации и растворители);

- данные исторического отрицательного (растворитель) и положительного контроля с диапазонами, средними значениями и стандартным отклонением и 95%-ными контрольными пределами распределения, а также количество данных;

- статистический анализ, p-значение (при наличии).

7.4.6 Обсуждение результатов

7.4.7 Выводы

Приложение А
(справочное)

Формулы для оценки цитотоксичности

А.1 При использовании cytoB

А.1.1 При использовании cytoB оценка цитотоксичности основана на индексе пролиферации при цитокинетическом блоке (CBPI) и индексе репликации (RI). CBPI показывает среднее число ядер на клетку и может использоваться для вычисления клеточной пролиферации. RI показывает относительное число клеточных циклов на клетку в течение периода воздействия cytoB в обработанных культурах по сравнению с контрольными культурами и может использоваться для вычисления процента цитостатичности по формулам:

_______________

См. [17], [69].

, (А.1)

где ;

T - культура, обработанная исследуемым химическим веществом;

C - контрольная культура.

Таким образом, значение CBPI=1 (все клетки с одним ядром) соответствует 100%-ной цитостатичности.

, (А.2)

где ;

T - обработанные культуры;

C - контрольные культуры.

А.1.2 Таким образом, значение RI, равное 53%, означает, что по сравнению с количеством клеток, которые разделились с образованием двуядерных и многоядерных клеток в контрольной культуре, только 53% клеток от этого числа разделились в обработанной культуре, то есть цитостатичность составляет 47%.

А.2 При отсутствии cytoB

А.2.1 Если cytoB не используют, оценку цитотоксичности рекомендуется проводить на основе относительного увеличения числа клеток (RICC) или относительного удвоения популяции (RPD) поскольку оба показателя учитывают долю популяции клеток, которые разделились. RICC и RPD вычисляют по формулам:

_______________

См. [69].

; (А.3)

, (А.4)

где удвоение популяции равно [log (число клеток после обработки/начальное число клеток)]/log 2.

А.2.2 Таким образом, значения RICC или RPD, равные 53%, указывают на значения цитотоксичности/цитостатичности, равные 47%.

А.2.3 С использованием индекса пролиферации (PI) цитотоксичность может быть определена путем подсчета числа клонов, состоящих из одной клетки (cl1), двух клеток (cl2), от трех до четырех клеток (cl4) и от пяти до восьми клеток (cl8) по формуле

. (А.5)

А.2.4 PI используют так же, как объективный и надежный параметр цитотоксичности для клеточных линий, культивируемых in vitro в отсутствие cytoB, который может рассматриваться как полезный дополнительный параметр.

_______________

См. [5], [36]-[38].

В любом случае количество клеток должно быть одинаковым для обрабатываемых культур и отрицательного контроля.

Больше не рекомендуется использовать в качестве параметра цитотоксичности использовавшийся ранее RCC (т.е. количество клеток в обработанных культурах/количество клеток в контрольных культурах), поскольку данный параметр может занижать оценку цитотоксичности.

При использовании автоматизированных систем подсчета, например проточной цитометрии, лазерной сканирующей цитометрии или анализа изображений, количество клеток в формуле (А.5) может быть заменено количеством ядер.

В культурах отрицательного контроля индекс удвоения популяции или индекс репликации должны быть совместимыми с требованием отбора образцов клеток после обработки во время, эквивалентное примерно 1,5-2 нормальным клеточным циклам.

Приложение ДА
(справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа

Таблица ДА.1

Библиография

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена