ГОСТ Р 52832-2007
(ИСО 8870:2006)
Группа Н09
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО И ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МОЛОКА
Обнаружение термонуклеазы, образуемой
коагулазоположительными стафилококками
Milk and milk-based products - Detection of thermonuclease
produced by coagulase-positive staphylococci
ОКС 67.100.01
Дата введения 2009-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" совместно с ГУ Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 459-ст
4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 8870:2006 "Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками" (ISO 8870:2006 "Milk and milk-based products - Detection of thermonuclease produced by coagulase-positive staphylococci"). При этом дополнительные слова, фразы, показатели и их значения, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает качественный метод определения термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками в молоке и продуктах на основе молока.
Наличие в молоке и продуктах на основе молока термонуклеазы может использоваться как индикатор достижения роста стафилококков опасного уровня и отражать вероятное присутствие стафилококкового энтеротоксина.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 51446-99 Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований (ИСО 7218-96 "Микробиология продуктов питания и кормовых продуктов. Общие правила микробиологических исследований", MOD)
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:
3.1 термонуклеаза (thermonuclease): Фермент, образуемый коагулазоположительными стафилококками, гидролизирующий дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) при условиях, описанных в настоящем стандарте.
4 Сущность метода
_________________
* Наименование пункта отмеченного знаком "*" в бумажном оригинале веделено курсивом, здесь и далее по тексту. - .
Метод основан на расщеплении ДНК термонуклеазой, при котором цвет агара изменяется с синего на розовый. Цветная реакция обусловлена метахроматическими свойствами толуидинового синего О.
5 Подготовка к испытанию
5.1 Основные материалы
Для текущей лабораторной практики см. ГОСТ 9225.
Используют реактивы только аналитического качества, если не оговорено иначе, и только дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты.
Если приготовленные среды и реактивы не используют немедленно, их хранят, если не оговорено иначе, в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С не более 1 мес в условиях, предотвращающих любые изменения в их составе.
5.2 Толуидиновый синий О-ДНК агар
5.2.1 Трис-буфер
5.2.1.1 Состав:
трис(гидроксиметил)аминометан (C
хлорид кальция (CaCl
вода - 1000 см
5.2.1.2 Приготовление
Растворяют трис(гидроксиметил)аминометан и хлорид кальция в 980 см
5.2.2 Основа среды
5.2.2.1 Состав:
дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - 0,3 г;
хлорид натрия (NaCI) - 10,0 г;
агар - 10,0 г;
трис-буфер (см. 5.2.1) - 1000 см
5.2.2.2 Приготовление
Компоненты нагревают на водяной бане (см. 6.2) до полного растворения ДНК и агара (около 1,5 ч).
5.2.3 Раствор толуидинового синего О
5.2.3.1 Состав:
толуидиновый синий О (С
вода - 10 см
5.2.3.2 Приготовление
Толуидиновый синий О растворяют в воде при слабом нагревании и фильтруют через марлю (см. 6.12).
5.2.4 Полная среда
5.2.4.1 Состав:
основа среды (см. 5.2.2) - 1000 см
раствор толуидинового синего О (см. 5.2.3) - 3 см
5.2.4.2 Приготовление
Основу среды охлаждают до (50±1) °С, добавляют профильтрованный раствор толуидинового синего О и перемешивают.
Полная среда может храниться маленькими порциями в закупоренных колбах или бутылях несколько месяцев в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С.
5.2.5 Приготовление чашек со средой
В чашки Петри (см. 6.8) вносят по 13 см
Приготовленные среды могут храниться не более 2 мес (дном кверху и защищенными от высыхания) в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С.
5.3 Соляная кислота,
5.4 Гидроокись натрия,
5.5 Трихлоруксусная кислота,
Растворяют 49,02 г трихлоруксусной кислоты в 100 см
5.6 Обезжиренное сухое молоко
Обезжиренное сухое молоко должно быть свободно от термонуклеазы. Наличие термонуклеазы проверяют в каждой новой партии, используя метод, приведенный в настоящем стандарте.
5.7 Бульон на основе сердечно-мозгового перевара (бульон ВНI)
5.7.1 Состав:
ферментативный перевар животных тканей - 10,0 г;
обезвоженный перевар телячьего мозга - 12,5 г;
обезвоженный перевар бычьего сердца - 5,0 г;
глюкоза - 2,0 г;
хлорид натрия - 5,0 г;
моногидрофосфат натрия, безводный (Na
вода - 1000 см
5.7.2 Приготовление
Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают такой уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал 7,4±0,2 при температуре 25 °С.
Среду разливают по 5 см
Среду стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин.
5.8 Тест-микроб (положительный контроль)
В качестве положительного контроля используют любой штамм Staphylococcus aureus, образующий термонуклеазу.
6 Оборудование и лабораторная посуда
________________
* Слова "и лабораторная посуда" в бумажном оригинале выделены купсивом. - .
Используют оборудование, необходимое для подготовки проб согласно ГОСТ Р 51446, обычное лабораторное оборудование, а также следующее:
6.1 Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С.
6.2 Водяная баня, поддерживающая температуру (50±1) °С, а также температуру кипячения (для разогрева и охлаждения питательных сред и реактивов до необходимой температуры).
6.3 Центрифуга с частотой вращения более 27000 мин
6.4 Центрифуга с частотой вращения более 2800 мин
6.5 Металлический цилиндрический пробойник диаметром около 2 мм, для прорезания лунок в толуидиновом синем О-ДНК агаре.
6.6 Микропипетки вместимостью 0,01 см
6.7 Бактериологические петли из проволоки платино-иридиевого или никельхромового сплава диаметром около 3 мм.
6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, диаметром 90 и 100 мм.
6.9 Мерные цилиндры вместимостью 10, 100 и 1000 см
6.10 Бутыли с пробками, для хранения толуидинового синего О-ДНК агара.
6.11 Пробирки диаметром 15 мм и длиной 100 мм.
6.12 Марля.
При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.
Стеклянная лабораторная посуда должна выдерживать повторные циклы стерилизации и быть химически инертной.
7 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуемым методом отбора проб является метод, приведенный в ГОСТ 26809.
Образцы хранят в условиях, предотвращающих их порчу и любые изменения в составе.
8 Проведение испытания
Величину рН молока, восстановленного сухого молока или гомогенизированных продуктов на основе молока после добавки обезжиренного сухого молока доводят до 3,8 и центрифугируют. Супернатант осаждают трихлоруксусной кислотой. Центрифугируют, рН осадка доводят до рН 8,5 и добавляют трис-буфер. Раствор прогревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин и определяют наличие термонуклеазной активности на толуидиновом синем О-ДНК агаре.
8.1 Подготовка образцов
8.1.1 Молоко
рН пробы молока объемом 100 см
8.1.2 Продукты на основе молока
Суспензируют 20 г образца и 5 г обезжиренного сухого молока (см. 5.6) в 50 см
Добавление обезжиренного сухого молока не является обязательным для всех продуктов на основе молока. При исследовании, например, сухого обезжиренного молока, цельного сухого молока или казеинов его можно не добавлять. Добавление обязательно в случае сухой сыворотки, йогурта, фруктового йогурта и фруктового мороженого. Для остальных продуктов на основе молока добавление обезжиренного сухого молока также рекомендуется.
Для испытания сыра можно использовать альтернативную процедуру. Суспензируют с помощью блендера 20 г сыра в 100 см
Если сухое обезжиренное молоко не добавляется, суспензируют 20 г в 40 см
8.1.3 Общий ход испытания
8.1.3.1 Центрифугируют (см. 6.3) пробу с частотой вращения от 27000 мин
8.1.3.2 Супернатант декантируют. Добавляют 0,05 см
8.1.3.3 Центрифугируют с частотой вращения от 27000 мин
8.1.3.4 Осадок растворяют в 1 см
8.1.3.5 Раствор прогревают в кипящей водной бане (см. 6.2) в течение 15 мин.
8.2 Приготовление тест-культуры (положительный контроль)
8.2.1 Тест-культуру (см. 5.8) засевают в бульон BHI (см. 5.7). Инкубируют 24 ч при (37±1) °С. Центрифугируют (см. 6.4) с частотой вращения от 2800 мин
8.2.2 Супернатант прогревают на кипящей водяной бане (см. 6.2) в течение 15 мин. Прогретый супернатант может храниться при температуре 5 °С не более четырех недель.
При необходимости любой штамм Staphylococcus aureus (например, выделенный из молока или продуктов на основе молока) может быть исследован на наличие термонуклеазы методом, приведенным выше для тест-культуры.
8.3 Приготовление толуидинового синего О-ДНК агара
Цилиндрическим пробойником (см. 6.5) в агаре (см. 5.2.5) прорезают две лунки. Агар поверхностью вниз подсушивают в термостате (см. 6.1) со снятой крышкой и в течение 60 мин при температуре (37±1) °С.
При испытании нескольких образцов в одном агаре прорезают до 10 лунок.
8.4 Определение термонуклеазы
8.4.1 В одну из лунок вносят 10 мм
8.4.2 Чашки Петри с крышками сверху инкубируют (см. 6.1) 4 ч при температуре (37±1) °С. При отрицательном результате чашки инкубируют до 24 ч.
9 Обработка результатов
Розовое гало (ореол или зона свечения) диаметром более 1 мм вокруг лунки свидетельствует о наличии термонуклеазы (необходимо сравнить с положительным контролем). Гало любого иного цвета, кроме розового, не считается признаком термонуклеазной активности.
Положительный тест на термонуклеазу указывает на рост коагулазоположительных стафилококков в количестве до 10
Такое количество коагулазоположительных стафилококков может выработать энтеротоксин в концентрации, достаточной для развития заболевания. Молоко и продукты на основе молока, в которых при использовании настоящего метода испытаний выявлена термонуклеаза, образуемая коагулазоположительными стафилококками, в обязательном порядке подлежат проверке на наличие энтеротоксина.
10 Протокол испытания
В протоколе испытания указывают:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
- метод отбора проб;
- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
- все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;
- полученные результаты и повторяемость (если определялась), окончательный уточненный результат испытания.
Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2008
